Tid til at indlede indlejret PCR

Sådan får du et renere PCR-produkt og reducerer ikke-specifik forstærkning

medmindre du har fået dine hænder på nogle mirakuløst specifikke primere, kan forstærkning af kun din målsekvens uden ikke-specifik forstærkning være meget udfordrende. Heldigvis er en smart og overraskende enkel løsning ved hånden!

en hurtig oversigt over det grundlæggende

i PCR designer du dine primere til at binde til den sekvens, du vil forstærke. Der bruges et par primere, kaldet de forreste og omvendte primere, for at sikre, at begge tråde i din sekvens forstærkes. Håbet er, at du efter 30-40 cyklusser har et næsten rent produkt, som du kan arbejde med. Desværre er dette håb mere som en drøm, når dine primere er mindre kræsne, end du gerne vil have, når det kommer til hvilke sekvenser de vil binde. Slutresultatet er et urent produkt, der kan være ubrugeligt, afhængigt af hvor meget ikke-specifik binding der opstod, og for hvad du har brug for PCR-produktet.

en simpel løsning: indlejret PCR

indlejret PCR er en virkelig elegant løsning. Det bruger to par primere: det første sæt binder din målsekvens, men i stedet for at binde tæt til begyndelsen af sekvensen, designer du dem til at binde lidt længere væk (ved sæt mener vi en fremad og omvendt primer). Du kører din PCR og ender med et produkt, der indeholder både målsekvensen og ikke-specifikke sekvenser. Du bruger derefter et andet sæt primere, som er designet som du normalt ville designe primere, hvor de binder ved eller nær begyndelsen af målsekvensen.

at have to par primere fungerer som en dobbeltkontrol. Der kan være flere sekvenser i dit udgangsmateriale, der indeholder en række baser, som et sæt primere vil binde til, men det er statistisk meget usandsynligt, at de vil indeholde basisstrenge, der er i stand til at binde begge sæt primere. Derfor kan du være sikker på, at dit produkt er, hvad du har brug for det på grund af dette ekstra niveau af selektivitet. Du kan lære mere om indlejrede primere og deres rolle i TAIL-PCR her og se en visuel repræsentation af processen her.

yderligere Tips til at øge din specificitet

specificiteten af PCR bestemmes af specificiteten af PCR-primerne. Dette er en af de kardinale regler for PCR. For at øge specificiteten af dine primere, prøv følgende:

  1. BLAST Search
    udfør en BLAST søgning for at se, om dit gen/sekvens af interesse er blevet sekventeret før. I så fald kan dette give dig mulighed for at designe meget specifikke primere.
  2. elektronisk PCR
    en anden teknisk løsning er elektronisk PCR, som giver dig mulighed for at køre en computersimulering af PCR-processen for at kontrollere det teoretiske resultat af din PCR.
  3. længere primere er mindre tilbøjelige til at binde andre sekvenser, da der er mindre chance for, at de binder effektivt nok til at muliggøre amplifikation, selvom der er en balance, og primere kan være for lange (Se her.)
  4. for mange G-og C-baser i en primer gør det for klæbrigt. Desværre er for få G ‘er og C’ er og dine primere usandsynligt at anneale noget. Der er en balance, men normalt er et GC-indhold på 40-60% ideelt.
  5. Find den optimale udglødningstemperatur. Dette er den temperatur, hvor mindst 50% af primerne binder deres komplementære sekvens. Hvis temperaturen er for lav, bliver primerne mere tilbøjelige til at binde ikke-specifikke sekvenser. Hvis du ikke kender den optimale temperatur, kan du enten bruge PCR (forudsat at du ikke behøver at vide, hvad temperaturen viste sig at være) eller bruge en anden udglødningstemperatur for hver brønd og se, hvilket produkt der er det reneste ved gelelektroforese (forudsat at du gerne vil vide, hvad den optimale udglødningstemperatur er).
  6. en ubalance i koncentrationen af dNTPs kan også forårsage problemer, ligesom en for høj koncentration af dNTPs kan. Dobbelttjek din opskrift med en kollega, hvis det er tilfældet.
  7. nogle tilsætningsstoffer kan bruges til at destabilisere DNA-duplekser, hvis du har mistanke om, at primerdimerer eller sekundære strukturer som hårnåle forårsager et problem. Prøv først at reducere din koncentration af magnesiumchloridioner, da dette kan reducere ikke-specifik binding, da højere koncentrationer af ionen stabiliserer duplekser. Manglende at tilføje DMSO kan hjælpe. Du kan finde en liste over forskellige tilsætningsstoffer til PCR her.
  8. hvis ikke alt dette, prøv en hot-start polymerase. Disse polymeraser fungerer kun ved højere temperatur, hvilket forhindrer amplifikation ved lavere temperatur, når primerne lettere binder til ikke-målsekvenser.

Tilføj venligst dine egne tip i kommentarerne nedenfor.

termisk asymmetrisk Interlaced PCR (TAIL-PCR) (for at lære om en af de former for PCR, der er afhængig af indlejrede primere)

indlejrede primere til PCR (for et billede af, hvordan indlejrede primere fungerer)

(for at lære om, hvordan du øger effektiviteten af dine primere, hvis du bruger TAIL-PCR)

har dette hjulpet dig? Så del venligst med dit netværk.

skrevet af Reina

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.