Servizi di microiniezione

Il Servizio di microiniezione (MIJ) comprende le strutture, la strumentazione e le competenze tecniche necessarie per effettuare la microiniezione, un passo essenziale nel processo di creazione di un modello di topo geneticamente modificato. Lo staff del MIJ svolge l’attività quotidiana di gestione delle colonie di topi, superovulazione, raccolta di embrioni, iniezione pronucleare, citoplasmatica e blastocista e chirurgia di trasferimento di embrioni. Le offerte di servizi includono la microiniezione di reagenti CRISPR o un costrutto del DNA, incluso il BAC (cromosoma artificiale batterico), nello zigote di molti ceppi di topi inbred e speciali. Offriamo anche l’iniezione di cellule ES sia in blastocisti che in embrioni a stadio 8 cellule di ceppi di topi convenzionali e la combinazione di colori del mantello viene utilizzata quando possibile per facilitare la valutazione del chimerismo. I servizi MIJ hanno anche avuto molto successo nella creazione di modelli animali knockout utilizzando le tecnologie ZFN (Zinc Finger Nuclease) e TALEN (Transcription Activator Like Effector Nuclease) direttamente su ceppi inbred e speciali. Il servizio di microiniezione ha attualmente 5 stazioni di microiniezione complete e 3 stazioni chirurgiche complete. Le attrezzature chiave includono: 3 macchine per anestesia VetEquip, 3 sistemi laser XYClone, 14 stereomicroscopi, 6 incubatori da banco, 2 estrattori per micropipette Sutter e 2 Kopf, 2 trapani piezoelettrici e 3 microforghe.

Mouse Modello di produzione:

  • I modelli Knockout e knockin mouse vengono prodotti iniettando reagenti CRISPR negli zigoti (0,5 dpc) del ceppo ospite desiderato. Questi embrioni si sviluppano a termine dopo il trasferimento chirurgico in un topo femmina pseudopregnante CByB6F1/J ricevente. L’RNA guida riconosce il locus genomico mediante accoppiamento di base e la nucleasi Cas9 genera una rottura a doppio filamento (DSB) nel genoma. Se non viene utilizzato il DNA del donatore, il DSB viene riparato dal meccanismo soggetto all’errore di nonhomologous end joining (NHEJ) che spesso porta una mutazione frameshift. Tuttavia, quando viene fornito e utilizzato il DNA del donatore, la riparazione diretta all’omologia (HDR) medierà l’incorporazione di una mutazione puntiforme, l’inserimento di un tag o di un sito loxP o lo scambio del gene murino con il suo ortologo umano.
  • Topi transgenici sono prodotti da microiniezione un costrutto gene purificato nel pronucleo di zigoti (0,5 dpc) del ceppo ospite desiderato. Questi embrioni si sviluppano a termine dopo il trasferimento chirurgico in un topo femmina pseudopregnante CByB6F1/J ricevente. I cuccioli risultanti vengono trasferiti allo sperimentatore per l’identificazione dei portatori di transgene. Questi topi “fondatori” vengono quindi allevati dallo sperimentatore per l’analisi dell’espressione.
  • I topi mutanti mirati sono prodotti microiniettando cellule staminali embrionali geneticamente modificate in embrioni di topo allo stadio di blastocisti (3,5 dpc). Dopo il trasferimento chirurgico e lo sviluppo a termine, le chimere (derivate sia dall’embrione ospite che dalle cellule introdotte) vengono identificate dal colore del mantello e allevate dallo sperimentatore per la trasmissione della linea germinale del lignaggio cellulare ES manipolato.

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