Tempo di istigare la PCR nidificata

Come ottenere un prodotto PCR più puro e ridurre l’amplificazione non specifica

A meno che tu non abbia messo le mani su alcuni primer miracolosamente specifici, l’amplificazione della sola sequenza di destinazione senza amplificazione non specifica può essere molto impegnativa. Per fortuna, una soluzione intelligente e sorprendentemente semplice è a portata di mano!

Un rapido riassunto delle nozioni di base

In PCR, si progettano i primer per legarsi alla sequenza che si desidera amplificare. Viene utilizzata una coppia di primer, chiamati primer avanti e indietro, per garantire che entrambi i trefoli della sequenza siano amplificati. La speranza è che dopo 30-40 cicli, avrai un prodotto quasi puro con cui lavorare. Sfortunatamente, questa speranza è più simile a un sogno quando i tuoi primer sono meno schizzinosi di quanto vorresti quando si tratta di quali sequenze legheranno. Il risultato finale è un prodotto impuro che potrebbe essere inutilizzabile, a seconda di quanto non specifico legame si è verificato e per ciò che è necessario il prodotto PCR.

Una soluzione semplice: Nested PCR

Nested PCR è una soluzione davvero elegante. Utilizza due coppie di primer: il primo set lega la sequenza di destinazione ma piuttosto che legarsi strettamente all’inizio della sequenza, li disegni per legarli un po ‘ più lontano (per set intendiamo un primer avanti e indietro). Si esegue la PCR e si finisce con un prodotto che contiene sia la sequenza di destinazione che le sequenze non specifiche. Si utilizza quindi un secondo set di primer, che sono stati progettati come normalmente si progettano primer, dove si legano all’inizio o vicino alla sequenza di destinazione.

Avere due coppie di primer agisce come un doppio controllo. Ci possono essere diverse sequenze all’interno del materiale di partenza che contiene una stringa di basi a cui si legherà un set di primer, ma è statisticamente molto improbabile che conterranno stringhe di base in grado di legare entrambi i set di primer. Pertanto, puoi essere certo che il tuo prodotto è ciò di cui hai bisogno a causa di questo ulteriore livello di selettività. Puoi saperne di più sui primer nidificati e sul loro ruolo in TAIL-PCR qui e vedere una rappresentazione visiva del processo qui.

Ulteriori suggerimenti per aumentare la specificità

La specificità della PCR è determinata dalla specificità dei primer PCR. Questa è una delle regole cardinali della PCR. Per aumentare la specificità dei primer, prova quanto segue:

  1. BLAST Search
    Eseguire una ricerca BLAST per vedere se il gene/sequenza di interesse è stato sequenziato prima. Se è così, questo potrebbe consentire di progettare primer altamente specifici.
  2. PCR elettronico
    Un’altra soluzione tecnologica è la PCR elettronica che consente di eseguire una simulazione al computer del processo PCR per verificare l’esito teorico della PCR.
  3. I primer più lunghi hanno meno probabilità di legare altre sequenze poiché c’è meno possibilità che si leghino in modo abbastanza efficiente da consentire l’amplificazione, anche se c’è un equilibrio e i primer possono essere troppo lunghi (vedi qui.)
  4. Troppe basi G e C in un primer lo rendono troppo appiccicoso. Sfortunatamente, troppo pochi G e C e i tuoi primer sono improbabili per temprare qualsiasi cosa. C’è un equilibrio, ma di solito un contenuto di GC del 40-60% è l’ideale.
  5. Trova la temperatura di ricottura ottimale. Questa è la temperatura alla quale almeno il 50% dei primer legherà la loro sequenza complementare. Se la temperatura è troppo bassa, i primer diventano più propensi a legare sequenze non specifiche. Se non si conosce la temperatura ottimale, è possibile utilizzare la PCR touchdown (supponendo che non sia necessario sapere quale sia la temperatura) o utilizzare una temperatura di ricottura diversa per ciascun pozzetto e vedere quale prodotto è il più puro mediante elettroforesi su gel (supponendo che si desideri sapere qual è la temperatura di ricottura ottimale).
  6. Uno squilibrio nella concentrazione di DNTP può anche causare problemi, così come una concentrazione troppo alta di DNTP. Ricontrolla la tua ricetta con un collega per ogni evenienza.
  7. Alcuni additivi possono essere utilizzati per destabilizzare i duplex del DNA se si sospetta che i dimeri di primer o le strutture secondarie come le forcine stiano causando un problema. In primo luogo, provare a diminuire la concentrazione di ioni cloruro di magnesio in quanto ciò può ridurre il legame non specifico poiché concentrazioni più elevate dello ion stabilizzano i duplex. In mancanza di tale aggiunta DMSO può aiutare. Puoi trovare un elenco di vari additivi per PCR qui.
  8. In mancanza di tutto questo, provare una polimerasi hot-start. Queste polimerasi funzionano solo a temperature più elevate impedendo l’amplificazione a temperature più basse quando i primer si legano più facilmente a sequenze non bersaglio.

Si prega di aggiungere i propri suggerimenti nei commenti qui sotto.

Termica Asimmetrica Interlacciato PCR (CODA-PCR) (per conoscere una delle forme di PCR che si basa su nidificati primer)

Annidati Primer per la PCR (per un visual su come nidificati primer di lavoro)

(per ulteriori informazioni su come aumentare l’efficienza del primer se si utilizza TAIL-PCR)

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Scritto da Olwen Reina

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