신경-온-어-칩 플랫폼을 이용한 3 차원 기능성 인간 말초신경을 시험관 내에서 공학화

슈반 세포 배양

티-75 배양 플라스크(353136;코닝,코닝,뉴욕)를 멸균 여과된 0.1%폴리-오르니틴으로 코팅하여 제조하였다.시그마-알드리치,세인트 루이스,미주리)멸균 물(시그마-알드리치,세인트 루이스,미주리)의 용액. 그런 다음 플라스크를 멸균 물 4 회 세척하였다. 이 약은 10-20 분 동안 복용 할 수 있습니다. 루이스,미주리)에서 인산염-buffered saline(PBS;케이슨 연구소,스미스 필드,UT)에 추가되었 플라스크,어떤에서 개최되었 4°C 다. The Laminin 솔루션을 흡입,15mL 의 문화 중간 직접적으로 배치 T-75 문화 플라스크는 다음 equilibrated 에 37°C 의 인큐베이터 전 세포 도금입니다.

인간 슈반 세포 배지는 사이언셀(캘리포니아 주 칼스배드)으로부터 구입되었다. 인간의 1 차 슈반 세포(고양이. 1700 호;사이언셀)을 5 개 이상의 105 개의 세포/밀리리터 이상의 냉동젖으로 투여하였다. 바이알을 냉동 보존으로부터 제거하고 37 물 욕조에서 해동시켰다. 상기 바이알의 내용물을 플로/라미닌-코팅 티-75 플라스크 상에 균일하게 분배하였다. 배양은 5%의 이산화탄소 대기에서 16 시간 이상 그대로 유지되어 부착과 증식을 촉진시켰다. 배양 배지는 24 시간마다 변경되었습니다. 에 도달하 80%포화 상태,시 hSCs 었 계대를 사용하여 3mL Accutase®(Sigma-Aldrich),는 추가되었 플라스크에 대한 3 분 37°C. 한 번 세포를 완전히 분리,8mL hSC 매체 플라스크에 넣. 11mL 솔루션의 분리 hSCs 으로 이동했 15mL 원추형 튜브 와전에 200×g(Eppendorf5810 을 R 기 분리기,18cm radius;Eppendorf,Hamburg,Germany)에서 5 분간 실온(RT,약 22°C). 상기 상청액을 흡인하고,상기 펠릿을 1 밀리리터의 하이드록시스배양액에서 재투입하였다. 세포는 종래의 혈구계(하우서 과학,호샴,펜실바니아)를 사용하여 계수되었다.

운동 뉴런 배양

운동 뉴런 배양

운동 뉴런 배양

운동 뉴런 배양; 후지 필름 세포 역학,주식 회사)배지를 100 밀리리터의 아이셀 세포 역학,주식 회사,매디슨,위스콘신)을 사용하여 제조 하였다. 을 준비하기 위해 해빙 hNs,hNs 매체로 따뜻하게 RT1mL hNs 중에 추가되었 멸균 50mL 원추형 튜브입니다. 약 2 분 및 30 초 동안 37 개의 물 욕조에서 1 개의 바이알을 해동시켰다. 바이알 내용물을 50 밀리리터의 원추형 튜브로 옮겨서 1 밀리리터의 헥토닌 배지를 소용돌이치는 동작으로 떨어뜨려 세포 용액을 완전히 혼합하고 해동된 세포에 대한 삼투압 충격을 최소화하였다. 그 후,세포 바이알을 1 밀리리터의 수액으로 헹구어 50 밀리리터의 튜브로 옮겼다. 그 후,용액의 부피를 10 밀리리터에 천천히 50 밀리리터의 원심분리관(2-3 방울/초)에 서서히 첨가함으로써 소용돌이치면서 10 밀리리터의 원심분리관(2-3 방울/초)으로 끌어 올렸다. 그 후,세포 용액을 15 밀리리터의 원추형 튜브로 옮기고 200 에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고,세포를 1 밀리리터의 고농축액 배지에 재투입하여 튜브를 쓸어넘긴 다음 2-3 회 위아래로 피펫팅하였다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포 수를 수행하기 위해 10 개의 세포 용액 샘플을 채취했습니다.

회전 타원체 제작

비 취급,clear,”U”라운드 아래쪽,96 론,회전 타원체 마이크로플레이트(4515;코닝)사용에 대한 두 monocultures 의 hNs 및 hSCs 뿐만 아니라 공동의 문화 hNs/hSCs. 세포 내 농도는 다음과 같은 크기 및 조성의 회전 타원체를 생산하는 데 필요한 부피의 계산을 허용하기 위해 수산화 나트륨 및 수산화 나트륨 모두에 대해 계산되었다:수산화 나트륨 단일 배양-100000,75000,50000,또는 25000;수산화 나트륨 단일 배양-75000,50000 또는 25000;및 공동 배양,75000 75000,50000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 또는 25000 호호호호호호호호호호호 작곡은 우리가 채널에서 최대 축삭 밀도를 얻기 위해 듀얼 하이드로 겔 시스템의 차원에서 가장 큰 가능한 회전 타원체에 맞게 할 수 있도록 선택되었다,따라서 전기 생리 학적 기록을보다 안정적으로 만들기. 계산된 부피를 마이크로웰 플레이트에 첨가한 후,각 웰의 부피를 200 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 37 에 가온하여 100 개의 신선한,데워진(37 개의 다)의 100 개의 배지로 대체하여 격일로 보충하였다.2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 달리 명시되지 않는 한 모든 용액은 멸균 여과 된 핍바이오틱스로 생성되었습니다. 외부 세포 제한적(즉,성장 저항성)광 번역 가능한 하이드로 겔은 폴리에틸렌 글리콜 디 메타 크릴 레이트 1000(페그 마;폴리 사이언스,워 링턴,펜실베이니아)및 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸 벤조일 포스 피 네이트(랩; 시그마 알드리치). 1:1 솔루션으로 30%와 1.1 밀리 랩 솔루션을 만들어 혼합했습니다. 15%용액을 무균 여과하고 트랜스웰 삽입물에 0.6 밀리리터의 부피를 넣고,디지털 마이크로미러 장치의 렌즈 아래에 위치시켰다. 1). 마스크 및 중합 파라미터는 상용 소프트웨어(4500 제어 소프트웨어,텍사스 인스트루먼트,달라스,텍사스)를 사용하여 선택되었으며,광 번역 가능한 용액의 조사는 385 나노 파장의 자외선을 사용하여 28-32 초 동안 발생했습니다. 치료 후,과도한 페그드마/랩 용액을 삽입물로부터 그리고 포토마스크에 의해 생성된 공극 내에서 제거하였다. 그런 다음 2%항생제/항진균제 세척 완충액(써모 피셔 사이언티픽,월튼,마)을 각각 10 분 동안 삽입물의 상단과 하단에 세 번 사용하여 구조물을 세척 하였다. 세척 버퍼는 삽입 및 내부 열쇠 구멍 모양의 채널에서 제거 하였다. 공극은 세포 투과성 스캐 폴드를 만들기 위해 8%성장 인자-감소 된 마트리 겔 매트릭스(코닝)로 조심스럽게 채워졌으며 37 에서 중합 할 수있었습니다.

그림 1

인간의 신경-온-어-칩의 제조 과정을 보여주는 연구 설계(에이-에이-아크)시스템을 특징으로 할 수있는 다양한 수단과 함께. “이 그림은 라이센스에 의해 참조가 적용되지 않습니다. 아니타 임팔 리아 조에 크레딧. 모든 권리 보유,허가”와 함께 사용.

하이드로겔 구조로 회전타원체를 옮기는 것

두 가지 유형의 매체가 하이드로겔을 포함하는 3 차원 구조물에서 수초화를 유도하기 위해 하이드로겔배지(상술)를 사용하여 생성되었다. 태아 소 혈청의 특징 10%,1%항생제-항진균제 완충액 1%를 사용하여 전 수초화 공동 배양 배지를 만들었습니다. 이 배양배지에서는 베타-신경 성장 인자와 함께 수초화 공동배양배지가 생성되었다.; 또한,아스코르브산(시그마-알드리치)과 아스코르브산(시그마-알드리치)을 함께 투여하여,아스코르브산(시그마-알드리치)을 투여하여,아스코르브산(시그마-알드리치)을 투여한다. 피펫을 사용하여 마이크로 플레이트에서 회전 타원체를 옮겨 35 밀리미터 조직 배양 처리 접시(세포 치료,페퍼 렐,마)에 놓았다. 회전 타원체는 3 차원 구조”전구 부분”에 배치 하였다(그림. 1)매트 리겔 내에서 멸균 된 뒤몽#5 미세 팁 집게(11295-10;뒤몽,몽티 뉴,스위스)를 사용합니다. 1.5 밀리리터의 수초화 배지를 최종적으로 6 웰 플레이트의 트랜스웰 막 아래에 배치하고,로드된 하이드로겔 구조물을 배양을 위해 5%이산화탄소 대기의 37 하이드로겔 배양기에 배치하였다. 매체의 절반 변화는 격일로 실행되었다. 모노 및 공동 배양 회전 타원체 모두 3 주 동안 수초화 공동 배양 배지로 전환되기 전에 1 주 동안 수초화 공동 배양 배지에 보관되었다.

면역 세포 화학

면역 세포 화학 슈반 세포의 이동 뿐만 아니라 뉴런의 3 차원 파생물을 평가 하기 위해 수행 되었다. 2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 100%의 트리톤-엑스-100(시그마-알드리치);및 0.4%의 소 혈청 알부민(시그마-알드리치)을 실온에서 1 시간 동안 투여한 후,다음 1 차 항체를 4 시간 동안 차단 용액에서 밤새 라벨링하였다.: 이 경우,쥐는 쥐의 몸체에 부착되어 있고,쥐는 쥐의 몸체에 부착되어 있고,쥐는 쥐의 몸체에 부착되어 있고,쥐의 몸체는 쥐의 몸체에 부착되어 있다. 또한 동일한 배양 조건 하에서 별도의 시험에 사용되었다.그 후,2 차 항체,알렉사 488 염소 안티-래빗 이그그(1:300,애브캠)또는 알렉사 568 염소 안티-마우스 이그그(1:300,애브캠)및 다피(1:200,시그마-알드리치)로 표지되었다. 2 차 항체 및 다피를 1 배 차단제 용액에 실온에서 어둠 속에서 90 분 동안 용해시켰다.플레이트를 5 회,각각 8 분 동안 세척하고,실온에서 어둠 속에서 피필을 사용하였다.그 후,플레이트를 파라필름화하고,좌절시키고,4 회에 보관하였다.

플라스틱 수지 임베딩

임베딩에 사용된 모든 재료는 별도의 언급이 없는 한 전자현미경 과학에서 구입되었으며 권장되는 개인 보호 장비를 갖춘 화학적 흐름 후드 아래에서 취급되었습니다. 면역 세포 화학에 사용되지 않은 하이드로 겔 구조물을 배양에서 제거하고 고정 전에 막 횡단 양쪽에서 세 번 잘 세척 하였다. 플라스틱 삽입은 단지 면역 염색을 수행하여 정량화하기 어려운 축삭의 미세 구조를 평가하는 데 필수적입니다. 하이드로겔 구조물을 실온에서 4%/0.5%글루 타르 알데히드의 용액에 30 분 동안 담갔다.세포 지질의 2 차 고정 및 염색은 실온에서 어두운 조건 하에서 2 시간 동안 1%오스뮴 사옥 시드로 후 고정에 의해 달성되었다. 15 분 동안 3 회 세척 하였다.탈수는 50%에탄올/에탄올로 10 분 세척,70%에탄올/에탄올로 10 분 세척 및 95%에탄올/에탄올로 10 분 세척으로 시작하여 등급 에탄올 세척으로 수행되었다. 다음 날,구조물을 실온에서 30 분 동안 100%에탄올로 두 번 세척 하였다.

메스로 하이드로 겔 구조물을 해부 현미경으로 페그 드마를 제거하지 않고 막 횡단 우물에서 개별적으로 해부했습니다. 구조물은 평평한 임베딩 몰드에 배치되었습니다. 남은 에탄올은 스퍼 레르의 수지(저점도 임베딩 미디어 스퍼 레르의 키트;전자 현미경 과학)및 프로필렌 옥사이드의 1:1 혼합물로 구성된 침투 매질로 대체하기 전에 고정 된 하이드로 겔으로부터 증발 할 시간이 주어졌다. 침투 배지를 75 분 동안 방치 한 후 100%스퍼 러의 수지로 대체했으며,이는 70 제곱 오븐에서 밤새 경화되었고,초 미세 크로톰 절편 전에 실온에서 48 시간 더 경화되었다.단편화 및 투과 전자현미경 검사

단편화 및 측정 평가는 루이지애나 주립대학교(배턴루지,라)의 공유 계측 시설에서 수행되었다. 초박형 섹션은 시편의 4 개 위치에서 80-100 나노 미터의 두께로 절단되었습니다: 전구가 채널 및 근위 채널(즉,전구 근처)및 원위 채널(그림 2)을 만난 조직의 전구 내에서. 1). 200 메쉬의 폼바 탄소 코팅 구리 격자 위에 섹션을 놓고 2%우라 닐 아세테이트의 물방울에 20 분 동안 부유시켜 금속을 함침시켰다.그런 다음 탈 이온 물 방울로 3 회 1 분 동안 헹구었다. 시각화하기 위해,전 1400 템(피바디,엄마)은 다양한 배율에서 120 킬로볼트 가속 전압과 함께 사용되었다.

Histomorphometric analysis

데이터 획득에서 TEM 의 이미지를 HNoaC 십자가 포함된 섹션은 다음과 같은 임상으로-관련 통계는 일반적으로 연결된 병리의 말초신경계:유수 및 수초 axon 직경,G-비율(즉,비율의 축삭 직경의 직경이 전 섬유),그리고 퍼센트의 유수 섬유입니다. 모든 메트릭은 3 개 이상의 어두운 미엘린 포장 층으로 둘러싸인 비 수초 축삭과 축삭을 모두 측정하여 두 개의 서로 다른 독립적 인 맹인 연구원에 의해 설명되었습니다. 지-비율 및 축삭 직경은 피지 16 에서 스케일,임계 값 및 측정 기능을 사용하여 측정되었습니다. 구조물 전체에서 찍은 10 개의 이미지가 측정을 위해 무작위로 선택되었습니다. 첫째,수초화 된 섬유는 3 개 이상의 미엘린 층류에 둘러싸인 것으로 확인되었으며,수초화되지 않은 섬유는 알몸이거나 슈반 세포에 의해 침몰되었습니다. 비수 화 된 섬유의 축삭 직경은 섬유의 영역을 찾기 위해 임계 값 기능을 사용하여 측정되었습니다. 그런 다음 이 측정에서 직경을 계산했습니다. 지-수초 섬유에 대한 비율 계산은 축삭 직경과 유사한 방식으로 내부 축삭 영역을 찾는 것으로 시작되었습니다(평균 직경을 추정하기 위해 전체 영역을 임계화합니다.)둘째,외부 영역을 측정하고 어두운 미엘린 라멜라를 포함시켰다. 슈반 세포의 큰 핵체 수초의 외부 범위를 측정 할 때 제외되었다. 그런 다음 면적 측정에서 내부 및 외부 직경을 계산했습니다. 지-비,전술 한 바와 같이,마지막으로 계산 하였다. 퍼센트 수초화는 또한 적어도 1 개의 수초화 섬유와 5 개의 비 수초화 섬유를 포함하는 전구의 목 부분에서 5 개의 현미경 사진을 샘플링하여 피지에서 평가되었습니다. 관찰 된 수초화 섬유의 간단한 집계와 관찰 된 총 섬유가 수초화 퍼센트를 계산하는 데 사용되었습니다.

전기 생리학

공동 배양에서 한 달 후,재구성 된 신경을 가진 트랜스웰 삽입물을 전기 생리 학적 테스트를위한 단계에 놓았다. 2 개의 튜브는,하나는 분배용이고 다른 하나는 흡인용이며,조직 샘플 위에 산소화된 인공 뇌척수액을 관류하기 위한 트랜스웰 삽입물의 가장자리를 따라 배치되었다. 복합 활동 전위(캡)를 기록 하기 위해 뽑아 유리 마이크로 피 펫 전극(1-4 엠 2015)클러스터 된 세포 체 근처 채널의 전구에 삽입 하 고 채널에서 성장 하는 축 삭 동심 바이폴라 백 금-이리듐 전극 위치 1-3 밀리미터 전구에 자극 했다. 100 배 이득 및 0.1 헤르츠 하이패스 3 킬로헤르츠 로우 패스 필터링에 설정된 증폭기에 연결되었다. 자극 펄스 높이 및 폭은 각각 10 볼트 및 200 제곱초 단위로 유지되었다. 샘플을 1 헤르쯔의 최대 반복 속도로 자극 하 고 샘플 당 적어도 50 자극을 적용 했다. 아날로그-디지털 변환기(파워 랩,광고 악기,콜로라도 스프링스,콜로라도 스프링스)를 사용하여 캡 파형을 시각화하고 랩 차트 소프트웨어(광고 악기)를 사용하여 추가로 저장했습니다. 캡 녹화 후,입체 현미경과 카메라를 사용하여,자극 및 기록 전극의 스냅 샷은 노스캐롤라이나 계산을 위해 그들 사이의 거리를 결정하기 위해 촬영되었다. 대기 시간 캡 피크 위치에 의해 자극 아티팩트의 위치를 빼서 측정 했다. 자극 및 기록 전극 사이의 거리를 대기 시간으로 나누어 평가 하였다.

통계

그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 투키 사후 테스트를 통한 분산(분산 분석)의 단방향 분석을 수행했습니다.,라호야,캘리포니아,미국)다른 종류의 회전 타원체 사이의 크기 차이를 평가합니다. 전기 생리학 분석을 위해 평균 및 표준 편차를 계산하고 페어링되지 않은 티 테스트를 수행했습니다(그래프 패드 소프트웨어.)피-값 0.05 는 평균 사이에 상당한 차이를 할당하는 데 사용되었습니다. 모든 데이터는 적어도 세 가지 다른 복제 실험을 사용하여 수집되었습니다.

답글 남기기

이메일 주소는 공개되지 않습니다.