Tid til Å Egge Nestet PCR

Slik Får Du Et Renere PCR-Produkt Og Reduserer Ikke-spesifikk Forsterkning

med Mindre du har fått hendene på noen mirakuløst spesifikke primere, kan forsterkning av bare målsekvensen uten ikke-spesifikk forsterkning være svært utfordrende. Heldigvis er en smart og overraskende enkel løsning for hånden!

En Rask Oppsummering Av Grunnleggende

I PCR utformer du primere for å binde til sekvensen du vil forsterke. Et par primere brukes, kalt forover og bakover primere, for å sikre at begge strengene i sekvensen forsterkes. Håpet er at etter 30-40 sykluser har du et nesten rent produkt som du kan jobbe med. Dessverre er dette håpet mer som en drøm når primerne dine er mindre kresne enn du vil når det gjelder hvilke sekvenser de vil binde. Sluttresultatet er et urent produkt som kan være ubrukelig, avhengig av hvor mye ikke-spesifikk binding som oppstod og for HVA DU trenger PCR-produktet.

En Enkel Løsning: Nestet PCR

Nestet PCR er en virkelig elegant løsning. Den bruker to par primere: det første settet binder målsekvensen din, men i stedet for å binde tett til begynnelsen av sekvensen, utformer du dem for å binde litt lenger unna (med sett mener vi en forover og bakover primer). Du kjører PCR og ender opp med et produkt som inneholder både målsekvensen og ikke-spesifikke sekvenser. Du bruker deretter et andre sett med primere, som er utformet som du normalt ville designe primere, hvor de binder ved eller nær begynnelsen av målsekvensen.

Å Ha to par primere fungerer som en dobbeltsjekk. Det kan være flere sekvenser i utgangsmaterialet som inneholder en streng av baser som ett sett av primere vil binde, men det er statistisk svært lite sannsynlig at de vil inneholde base strenger i stand til å binde både sett av primere. Derfor kan du være trygg på at produktet er hva du trenger det å være på grunn av denne ekstra nivå av selektivitet. Du kan lære mer om nestede primere og deres rolle i TAIL-PCR her og se en visuell representasjon av prosessen her.

Ytterligere Tips for Å Øke spesifisiteten

spesifisiteten TIL PCR bestemmes av SPESIFISITETEN TIL PCR-primerne. Dette er EN av kardinalreglene FOR PCR. For å øke spesifisiteten til primerne, prøv følgende:

  1. BLAST Search
    Utfør ET BLAST søk for å se om din gen / sekvens av interesse har blitt sekvensert før. I så fall kan dette tillate deg å designe svært spesifikke primere.
  2. Elektronisk PCR
    En annen teknisk løsning Er Elektronisk PCR som lar deg kjøre en datasimulering AV PCR-prosessen for å sjekke det teoretiske resultatet AV PCR.
  3. Lengre primere er mindre sannsynlig å binde andre sekvenser siden det er mindre sjanse for at de bindes effektivt nok til å tillate forsterkning, selv om det er en balanse og primere kan være for lange (se her.)
  4. For Mange g-og C-baser i en primer gjør det for klebrig. Dessverre er for få G og C og dine primere usannsynlig å anneal noe. Det er en balanse, men vanligvis er ET gc-innhold på 40-60% ideelt.
  5. Finn den optimale glødetemperaturen. Dette er temperaturen der minst 50% av primerne vil binde sin komplementære sekvens. Hvis temperaturen er for lav, blir primerne mer sannsynlig å binde ikke-spesifikke sekvenser. Hvis du ikke vet den optimale temperaturen, kan du enten bruke touchdown PCR (forutsatt at du ikke trenger å vite hva temperaturen viste seg å være) eller bruke en annen glødetemperatur for hver brønn og se hvilket produkt som er det reneste ved gelelektroforese (forutsatt at du vil vite hva den optimale glødetemperaturen er).
  6. en ubalanse i konsentrasjonen av dNTPs kan også forårsake problemer, som kan for høy konsentrasjon av dNTPs. Dobbeltsjekk oppskriften din med en kollega bare i tilfelle.
  7. noen tilsetningsstoffer kan brukes til å destabilisere DNA duplekser hvis du mistenker at primer dimerer eller sekundære strukturer som hårnåler forårsaker et problem. Prøv først å redusere konsentrasjonen av magnesiumkloridioner, da dette kan redusere ikke-spesifikk binding siden høyere konsentrasjoner av ion stabiliserer duplekser. Sviktende at å legge DMSO kan hjelpe. Du finner en liste over ulike tilsetningsstoffer for PCR her.
  8. Mislykkes alt dette, prøv en hot-start polymerase. Disse polymerasene virker bare ved høyere temperatur og forhindrer forsterkning ved lavere temperatur når primerne binder seg lettere til ikke-målsekvenser.

vennligst legg til dine egne tips i kommentarene nedenfor.

Termisk Asymmetrisk Interlaced PCR (TAIL-PCR) (for å lære om EN AV de FORMER FOR PCR som er avhengig av nestede primere)

Nestede Primere FOR PCR (for en visuell på hvordan nestede primere fungerer)

(for å lære om hvordan du kan øke effektiviteten av primere hvis du bruker TAIL-PCR)

har dette hjulpet deg? Vennligst del med nettverket ditt.

Skrevet Av Olwen Reina

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.