Engineering a 3D functional human peripheral nerve in vitro using the Nerve-on-a-Chip platform

Schwann cell culture

een T-75 culture kolf (353136; Corning, Corning, NY) werd bereid door coating met een steriel gefilterde 0,1% poly-L-ornithine (PLO; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) oplossing in steriel water (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). De kolf werd vervolgens vier keer met steriel water gewassen. 7,5 mL 10 µg/mL Laminine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; Caisson Labs, Smithfield, UT) werd toegevoegd aan de kolf, die ‘ s nachts op 4 °C werd gehouden. De Laminineoplossing werd aangezogen en 15 mL kweekmedium werd direct in de T-75 kweekkolf geplaatst, die vervolgens in een incubator van 37 °C werd geëquilibreerd alvorens de cel te plateren.

menselijk Schwann Celmedium werd gekocht van ScienCell (Carlsbad, CA). Primaire Humane Schwann-cellen (cat. 1700; ScienCell) werden ontvangen in een cryovial met naar verluidt meer dan 5 × 105 cellen / mL. De flacon werd verwijderd uit cryopreservatie en ontdooid in een waterbad van 37 °C. De inhoud van de injectieflacon werd gelijkmatig verdeeld over de PLO/met Laminine beklede T-75-kolf. De cultuur werd bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende ten minste 16 uur ongestoord gelaten om hechting en proliferatie te bevorderen. Kweekmedium werd elke 24 uur veranderd. Bij het bereiken van 80% samenvloeiing werden de HSC ‘ s gepasseerd met 3 mL Accutase® (Sigma-Aldrich), die gedurende 3 minuten bij 37 °C aan de kolf werd toegevoegd.nadat de cellen volledig waren losgemaakt, werd 8 mL HSC-medium in de kolf geplaatst. De 11 mL oplossing van losse hSCs werd verplaatst naar een 15 mL conische buis en gesponnen bij 200 × g (Eppendorf 5810 R centrifuge, 18 cm radius; Eppendorf, Hamburg, Duitsland) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT, ongeveer 22 °C). Het supernatant werd opgezogen en de pellet werd geresuspendeerd in 1 mL HSC-kweekmedium. De cellen werden geteld met behulp van een conventionele hemocytometer (Hausser Scientific, Horsham, PA).

motorneuroncultuur

iCell ® motorneuron (hNs) ; FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc) medium werd bereid met behulp van 100 mL iCell® neuronen Base Medium (FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc, Madison, WI) aangevuld met 2 mL iCell® Neural Supplement A en 1 mL iCell® Zenuwstelselsupplement. Ter voorbereiding op het ontdooien van hNs werd HNS medium opgewarmd tot RT en werd 1 mL hNs medium toegevoegd aan een steriele 50 mL conische buis. Eén injectieflacon hNs werd gedurende ongeveer 2 minuten en 30 seconden ontdooid in een waterbad van 37 °C. De inhoud van de injectieflacon werd overgebracht naar de 50 mL conische buis met 1 mL HNS medium, druppelsgewijs met een wervelende beweging, om de celoplossing volledig te mengen en osmotische shock op ontdooide cellen te minimaliseren. De celflacon werd vervolgens gespoeld met 1 mL HNS-medium en overgebracht naar de 50 mL tube. Het volume van de oplossing werd vervolgens gebracht tot 10 mL door langzaam HNS-medium druppelsgewijs toe te voegen aan de 50 mL centrifugebuis (2-3 druppels/sec) tijdens het ronddraaien. De celoplossing werd vervolgens overgebracht naar een conische buis van 15 mL en gecentrifugeerd bij 200 × g gedurende 5 minuten bij RT. Het supernatant werd opgezogen en de cellen werden geresuspendeerd in 1 mL HNS-medium door de buis te flikkeren en vervolgens 2-3 keer op en neer te pipetteren. Een 10 µL steekproef van celoplossing toen werd genomen om een celtelling gebruikend een hemocytometer uit te voeren.

sferoïde fabricage

een niet-behandelde, heldere, “u” Ronde Bodem, 96 well, sferoïde microplaat (4515; Corning) werd gebruikt voor zowel monoculturen van hNs en hSCs als co-culturen van hNs/hSCs. De concentratie van media in cellen/µL werd voor zowel hSCs als hNs berekend om de volumes te kunnen berekenen die nodig zijn voor de productie van sferoïden met de volgende afmetingen en samenstellingen: HNS monoculturen-100000, 75000, 50000 of 25000; HSCs monoculturen – 75000, 50000 of 25000; en coculturen 75000 hNs met ofwel 75000, 50000 of 25000 hSCs. De composities werden gekozen om ervoor te zorgen dat we de grootst mogelijke sferoïde in de dimensie van het dual-hydrogel systeem kunnen passen om maximale axonale dichtheid in het kanaal te verkrijgen, waardoor elektrofysiologische opnames betrouwbaarder worden. Het berekende volume werd toegevoegd aan microwell platen, vervolgens werd het volume van elke putje gebracht tot 200 µL door het toevoegen van media verwarmd tot 37 °C. De sferoïde microplaat werd vervolgens gecentrifugeerd bij 200 × g gedurende 5 minuten en geplaatst in een 37 °C incubator in een 5% CO2 atmosfeer totdat sferoïde vorming werd waargenomen (meestal rond 48 uur). De helft van het HNS-medium werd om de andere dag aangevuld door 95 µL te verwijderen en te vervangen door 100 µL vers, verwarmd hNs-medium (tot 37 °C).

fabricage van 3D Dual-hydrogel zenuwgroeiconstructies

op de membranen van Transwell®-inserts (0,4 µm/PES; Corning) werd een dual-hydrogel-steiger gemaakt met behulp van een micro-fotolithografietechniek die vergelijkbaar is met de eerder beschreven methoden 15. Alle oplossingen zijn gemaakt met steriel gefilterd PBS tenzij anders vermeld. De buitenste cel-beperkende (dat wil zeggen, groei-resistente) foto-translinkbare hydrogel werd gemaakt met behulp van een oplossing van polyethyleenglycol dimethacrylaat 1000 (PEGDMA; Polysciences, Warrington, PA) en lithium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP; Sigma Aldrich). Eerst werden 30% W/v PEGDMA en 1,1 mM ronde oplossingen gemaakt en gemengd in een 1:1 oplossing. De resulterende 15% – oplossing werd steriel gefilterd en toegevoegd aan Transwell ® – inserts die in een volume van 0,6 mL werden geplaatst terwijl ze onder de lens van een digitaal Micromirror-apparaat (DMD, Pro4500 Wintech Production Ready Optical Engine; Wintech Digital Systems Technology Corp, Carlsbad, CA) op met Rain-X (ITW Global Brands, Glenview, IL) behandelde glaslides werden geplaatst (Fig. 1). Het masker en de polymerisatieparameters werden geselecteerd met behulp van commerciële software (DLP Lightcrafter 4500 besturingssoftware, Texas Instruments, Dallas, TX), en bestraling van de fototranslinkbare oplossing vond plaats gedurende 28-32 seconden met behulp van het ultraviolet licht van 385 nm golflengte. Na behandeling werd overtollige PEGDMA/LAP-oplossing verwijderd uit de insert en uit de leegte die door het fotomasker werd gecreëerd. De constructies werden vervolgens gewassen met behulp van 2% antibioticum / Antimycotic wash buffer (Thermo Fischer Scientific, Walton, MA) drie keer op de boven-en onderkant van het tussenvoegsel voor 10 minuten elk. Wash buffer werd verwijderd uit het inzetstuk en de binnenste sleutelgat-vormige kanalen. De leegte werd zorgvuldig gevuld met 8% groeifactor-gereduceerde Matrigel® Matrix (Corning) om een celdoorlatende steiger te creëren en toegestaan om te polymeriseren in een 37 °C incubator.

figuur 1

studieontwerp toont het proces van het fabriceren van een menselijke zenuw-op-A-Chip (HNoaC) samen met verschillende middelen waarmee het systeem kan worden gekarakteriseerd. “Dit cijfer valt niet onder de CC BY licence. Dank aan Anita Impagliazzo. Alle rechten voorbehouden, gebruikt met toestemming”.

het overbrengen van sferoïden naar hydrogelconstructie

twee soorten media werden gemaakt met behulp van hNs-medium (hierboven beschreven) om myelinering te induceren in 3D-constructies die hNs bevatten. Een pre-myelination Co-culture medium werd gemaakt met behulp van HNS medium, 10% HyClone gekenmerkt foetaal Runderserum (FBS; LaCell LLC, New Orleans, LA), en 1% antibioticum-antimycotische buffer. Een Myelinatie Co-kweekmedium werd gecreëerd met hNs medium, 10% FBS, 10 ng / mL recombinant rat bèta-zenuw groeifactor (NGF; R&D Systems, Minneapolis, MN), en 50 µg / mL L-ascorbinezuur (Sigma-Aldrich). Na de vorming, sferoïden werden overgebracht van de microplaat met behulp van een pipet en geplaatst op een 35 mm Weefsel cultuur-behandelde schotel (Cell Treat, Pepperell, MA) in een druppel HNS medium. Sferoïden werden vervolgens geplaatst in de 3D construct “bulb portion” (Fig. 1) in de Matrigel, met behulp van gesteriliseerde Dumont # 5 pincet met fijne punt (11295-10; Dumont, Montignez, Zwitserland). 1.5 mL pre-myelinatiemedium werd uiteindelijk onder het Transwell® membraan van de 6-Wells platen geplaatst en de geladen hydrogelconstructies werden in een 37 °C incubator geplaatst in een 5% CO2 atmosfeer voor kweek. Halve veranderingen van het medium werden om de andere dag uitgevoerd. Zowel mono en co-cultuur sferoïden werden gehouden in de Pre-myelination co-cultuurmedium voor 1 week voordat wordt overgeschakeld naar Myelination co-cultuurmedium voor 3 weken.Immunocytochemie

Immunocytochemie

Immunocytochemie werd uitgevoerd om zowel de 3D-uitgroei van de neuronen als de migratie van de Schwann-cellen te beoordelen. Na vier weken in cultuur, werd de helft van de putten met hnoac systemen gewassen 3 keer met PBS, gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7,4; elektronenmicroscopie Wetenschappen, Hatfield, PA) voor 30 min bij RT, en gewassen met PBS 4 keer gedurende 15 minuten elk. Vaste monsters werden vervolgens in een 1x blokkerende oplossing met PBS geplaatst; 5% normaal geitenserum (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA); 0,2% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich); en 0,4% runderserumalbumine (Sigma-Aldrich) gedurende één uur bij RT, gevolgd door etikettering met de volgende primaire antilichamen ‘ s nachts in blokkerende oplossing bij 4 °C: konijn-α-s100 (ab868, 1: 400; Abcam, Cambridge, MA); of muis-α-ßIII tubuline (ab78078, 1:500; Abcam). Rabbit-α-myeline basic protein (MBP, ab133620, 1:500; Abcam) werd ook gebruikt in een afzonderlijke studie onder dezelfde incubatieomstandigheden.

de volgende dag werden putten gewassen met PBS 4 keer gedurende 8 minuten elk op RT. de plaat werd vervolgens geëtiketteerd met secundaire antilichamen, Alexa 488 goat anti-rabbit IgG (1:300, Abcam) of Alexa 568 goat anti-mouse IgG (1:300, Abcam), en DAPI (1:200, Sigma-Aldrich). Secundaire antilichamen en DAPI werden opgelost in 1x blocker oplossing gedurende 90 minuten in het donker op RT. de plaat werd 5 keer gewassen, gedurende 8 minuten elk, met PBS in het donker op RT. de plaat werd vervolgens geparafilmed, verijdeld, en bewaard bij 4 °C tot microscopie werd uitgevoerd met behulp van een Nikon A1 confocal microscoop (Nikon, Tokyo, Japan).

kunsthars inbedding

alle voor het inbedden gebruikte materialen zijn gekocht bij Elektronenmicroscopiewetenschappen, tenzij anders aangegeven, en werden behandeld onder een chemische afzuigkap met aanbevolen persoonlijke beschermingsmiddelen. Hydrogelconstructies die niet werden gebruikt voor immunocytochemie werden verwijderd uit de cultuur en gewassen drie keer aan beide zijden van de transmembrane goed met PBS bij RT voorafgaand aan fixatie. Plastic inbedding is essentieel voor het evalueren van de ultrastructuur van de axonen die moeilijk te kwantificeren is door alleen maar immunostaining uit te voeren. De hydrogelconstructies werden vervolgens gedurende 30 minuten bij RT gedrenkt in een oplossing van 4% PFA/0,5% glutaaraldehyde. secundaire fixatie en kleuring van cellulaire lipiden werd bereikt door postfixatie met 1% osmiumtetroxide in PBS, pH 7,4, gedurende 2 uur onder donkere omstandigheden bij RT. De constructies werden vervolgens gewassen met PBS 3 keer gedurende 15 minuten voorafgaand aan tegenkleuring met 2% waterige uranylacetaat gedurende 30 minuten onder donkere omstandigheden bij RT. dehydratie werd gedaan met gesorteerde ethanol wassen bij RT, te beginnen met een 10 minuten wassen met 50% ethanol/PBS, een 10 minuten wassen met 70% ethanol/PBS en een nacht wassen met 95% ethanol/PBS. De volgende dag werden de constructies tweemaal gewassen met 100% ethanol gedurende 30 minuten bij RT.

met een scalpel werden hydrogelconstructies afzonderlijk uit de transmembraanputten ontleed, zonder het PEGDMA te verwijderen, onder een dissectingmicroscoop. Constructies werden geplaatst in platte Inbedvormen (EMS 70902, elektronenmicroscopie Wetenschappen). Resterende ethanol werd tijd gegeven om te verdampen uit de vaste hydrogels voordat het werd vervangen door infiltratiemedium bestaande uit een 1:1 mengsel van Spurr ’s hars (Low Viscosity Embedding Media Spurr’ S Kit; elektronenmicroscopie Wetenschappen) en propyleenoxide. Het infiltratiemedium werd 75 minuten gelaten voordat het werd vervangen door 100% Spurr ’s hars, dat’ s nachts werd uitgehard in een oven van 70 °C en nog 48 uur bij RT voordat het ultramicrotoom werd verdeeld.

Sectioning and transmission electron microscopy (tem)

Sectioning and tem evaluation werd uitgevoerd in de Shared Instrumentation Facility (SIF) van de Louisiana State University (Baton Rouge, LA). Ultrathin secties werden gesneden tot een dikte van 80-100 nm op vier plaatsen binnen het hnoac-Monster: binnen de bol van het weefsel, waar de bol met het kanaal en het proximale kanaal (dat wil zeggen, in de buurt van de bol), en distale kanaal (Fig. 1). Secties werden geplaatst op Formvar koolstof gecoate koperen roosters, 200 mesh, en geïmpregneerd met metaal door drijvend op druppels van 2% uranylacetaat gedurende 20 minuten bij RT. ze werden vervolgens gespoeld met gedeïoniseerde waterdruppels 3 keer, gedurende 1 min. Om te visualiseren werd een JEOL 1400 TEM (Peabody, MA) gebruikt met een acceleratiespanning van 120 kV bij wisselende vergrotingen.

Histomorfometrische analyse

gegevens verkregen uit tem-beelden van hnoac-dwarsdoorsneden omvatten de volgende klinisch relevante metrics die vaak geassocieerd worden met pathologieën van het perifere zenuwstelsel: myelinated en unmyelinated Axon diameter, g-ratio (d.w.z. de verhouding tussen de Axon diameter en de diameter van de gehele vezel), en percentage gemyelineerde vezels. Alle metrics werden opgehelderd door twee verschillende, onafhankelijke, geblindeerde onderzoekers door het meten van zowel ongemyelineerde axonen als axonen omringd door 3 of meer lagen van donkere myeline verpakking. G-ratio en Axon diameter werden gemeten met behulp van de schaal -, drempel-en meetfuncties in Fiji16. Tien beelden uit de hele constructie werden willekeurig geselecteerd voor meting. Ten eerste werden gemyelineerde vezels geïdentificeerd als omgeven door 3 of meer myeline-laminae, terwijl niet-gemyelineerde vezels naakt waren of werden overspoeld door een Schwann-cel. De Axon diameter van de niet-gemyelineerde vezels werd gemeten met behulp van de drempelfunctie om het oppervlak van de vezel te vinden. De Diameter werd vervolgens berekend op basis van deze meting. G-ratio berekening voor myelinated vezels begon door het vinden van de binnenste axonale gebied op een soortgelijke manier Axon diameter(drempel het hele gebied om de gemiddelde diameter te schatten. Ten tweede werd het buitenste gebied gemeten en omvatte het donkere myeline lamellen. De grote kernlichamen van Schwann-cellen werden uitgesloten bij het meten van de buitenste omvang van de myelineschede. De binnen-en buitendiameters werden vervolgens berekend op basis van de oppervlaktemeting. De G-verhouding, zoals hierboven beschreven, werd als laatste berekend. Het percentage myelinatie werd ook geëvalueerd in Fiji door het bemonsteren van 5 micrografen uit het halsgedeelte van de bol die ten minste 1 myelinated vezel en 5 non-myelinated vezel bevatte. Een eenvoudige tally van myelinated vezels waargenomen, en totale vezels waargenomen werd gebruikt om procent myelination berekenen.

elektrofysiologie

na een maand in cocultuur werd de Transwell ® insert met de gereconstitueerde zenuw op een podium geplaatst voor elektrofysiologisch onderzoek. Langs de randen van de Transwell® – insert werden twee tubes geplaatst, één voor het doseren en de andere voor aspiratie, voor het perfuseren van zuurstofhoudende kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF)11 over weefselmonsters. Voor het registreren van compound action potentials (CAP) werd een pulled glass micropipette elektrode (1-4 MΩ) in de lamp van het kanaal in de buurt van de geclusterde cellichamen geplaatst, en de axonen die in het kanaal groeien werden gestimuleerd met een concentrische bipolaire platina-iridium elektrode gepositioneerd 1-3 mm distaal naar de lamp. Een platina opname elektrode werd geplaatst in de ACSF gevulde glazen micropipette en werd aangesloten op een versterker ingesteld op 100x gain en 0,1 Hz high pass tot 3 kHz low pass filtering. De hoogte en breedte van de stimulatiepuls werden op respectievelijk 10 volt en 200 µsec gehouden. Monsters werden gestimuleerd met een maximale herhalingssnelheid van 1 Hz, en ten minste 50 stimulaties werden per monster toegepast. Met behulp van een analoog-naar-digitaal converter (PowerLab; AD Instruments, Colorado Springs, CO), CAP golfvormen werden gevisualiseerd en verder opgeslagen met behulp van LabChart software (AD instruments). Na CAP-opname, met behulp van een stereomicroscoop en camera, werd een momentopname van de stimulerende en opname-elektroden genomen om de afstand tussen hen te bepalen voor NCV-berekening. De latentie werd gemeten door de locatie van stimulusartefact af te trekken door de pieklocatie van GLB. NCV voor gemyelineerde hmn / HSC co-culturen en niet-gemyelineerde hmn monoculturen werd geëvalueerd door de afstand tussen stimulerende en opnameelektroden te delen door latentie.

Statistics

One-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey post-hoc test werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) om de grootte verschillen tussen de verschillende soorten sferoïden te evalueren. Voor de analyse van elektrofysiologie werden gemiddelde en standaardafwijking berekend en werd een ongepaarde t-test uitgevoerd (GraphPad-Software.) Een p-waarde ≤ 0,05 werd gebruikt om significante verschillen tussen de middelen toe te wijzen. Alle gegevens werden verzameld met behulp van ten minste drie verschillende replicaten.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.