Inżynieria funkcjonalnego ludzkiego nerwu obwodowego 3D in vitro przy użyciu platformy nerw na chipie

kultury komórek Schwanna

kolbę do hodowli T-75 (353136; Corning, Corning, NY) przygotowano przez powłokę sterylnie filtrowaną 0,1% Poli-L-ornityną (PLO; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) roztwór w wodzie sterylnej (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Kolbę następnie przemyto cztery razy sterylną wodą. 7, 5 mL 10 µg/mL lamininy (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS; Caisson Labs, Smithfield, UT) dodano do kolby, którą trzymano w temperaturze 4 °C przez noc. Roztwór lamininy odsysano i 15 mL pożywki hodowlanej umieszczano bezpośrednio w kolbie hodowlanej T-75, którą następnie równoważono w inkubatorze o temperaturze 37 °C przed galwanizacją komórek.

ludzki nośnik komórek Schwanna został zakupiony w firmie ScienCell (Carlsbad, CA). Ludzkie pierwotne komórki Schwanna (Kat. No. 1700; ScienCell) otrzymano w kriowiale z podobno więcej niż 5 × 105 komórek / mL. Fiolkę wyjęto z kriokonserwacji i rozmrożono w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zawartość fiolki dozowano równomiernie na kolbę T-75 pokrytą PLO/Lamininą. Hodowlę pozostawiono w stanie nienaruszonym w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez co najmniej 16 godzin, aby promować przywiązanie i proliferację. Pożywka była zmieniana co 24 godziny. Po osiągnięciu 80% zbiegu, hscs przepuszczono za pomocą 3 mL Accutase® (Sigma-Aldrich), który dodano do kolby przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Po całkowitym odłączeniu komórek, 8 mL pożywki hSC umieszczono w kolbie. 11 mL roztworu odłączonego hSCs przeniesiono do stożkowej probówki o pojemności 15 mL i wirowano w temperaturze 200 × g (Wirówka Eppendorf 5810 R, promień 18 cm; Eppendorf, Hamburg, Niemcy) przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT, około 22 °C). Supernatant odsysano i osad ponownie zawieszono w 1 mL pożywki hodowlanej hSC. Komórki policzono za pomocą konwencjonalnego hemocytometru (Hausser Scientific, Horsham, PA).

kultura neuronów ruchowych

Icell® Motor Neuron (hNs; Nośnik FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc) został przygotowany przy użyciu 100 mL nośnika bazowego Icell® Neurons Base Medium (FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc, Madison, WI) uzupełnionego 2 mL suplementu neuronowego iCell® a i 1 mL suplementu układu nerwowego iCell®. Aby przygotować się do rozmrożenia hNs, podłoże hNs ogrzano do RT i Dodano 1 mL podłoża hNs do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mL. Jedną fiolkę hNs rozmrażano w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez około 2 minuty i 30 sekund. Zawartość fiolki przeniesiono do 50 mL stożkowej rurki zawierającej 1 mL pożywki hNs, kroplami, ruchem wirującym, w celu całkowitego wymieszania roztworu komórkowego i zminimalizowania wstrząsu osmotycznego na rozmrożonych komórkach. Następnie fiolkę z komórkami przepłukano 1 mL pożywki hNs i przeniesiono do probówki o pojemności 50 mL. Następnie objętość roztworu doprowadzono do 10 mL przez powolne dodawanie czynnika hNs do probówki wirówki o pojemności 50 mL (2-3 krople / s) podczas wirowania. Następnie roztwór komórkowy przeniesiono do stożkowej probówki o pojemności 15 mL i odwirowano w temperaturze 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Supernatant odsysano, a komórki ponownie zawieszono w 1 mL pożywki hNs, przesuwając probówkę, a następnie pipetując w górę iw dół 2-3 razy. Następnie pobrano 10 µL próbki roztworu komórkowego, aby wykonać liczbę komórek za pomocą hemocytometru.

wytwarzanie Sferoidów

do monokultur hNs i Hscs, jak również do współkultur hNs/hSCs, użyto nieoczyszczonego, przezroczystego, okrągłego DNA „U”, 96 studzienek, mikropłytki sferoidalnej (4515; Corning). Stężenie w komórkach / µL pożywki obliczono zarówno dla hSCs, jak i hNs, aby umożliwić obliczenie ilości potrzebnych do wytworzenia sferoidów o następujących rozmiarach i kompozycjach: mono-Kultury HNS-100000, 75000, 50000 lub 25000; mono-Kultury hSCs-75000, 50000 lub 25000; oraz kopolimery, 75000 hNs z 75000, 50000 lub 25000 hscs. Kompozycje zostały dobrane tak, aby zapewnić możliwość dopasowania największej możliwej sferoidy w wymiarze układu dualno-hydrożelowego w celu uzyskania maksymalnej gęstości aksonalnej w kanale, dzięki czemu nagrania elektrofizjologiczne są bardziej wiarygodne. Obliczoną objętość dodano do płyt mikrofalowych, a następnie objętość każdej studzienki doprowadzono do 200 µL przez dodanie pożywki ogrzanej do 37 °C. Następnie sferoidalną mikropłytkę odwirowywano w temperaturze 200 × g przez 5 minut i umieszczano w inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, aż do zaobserwowania powstawania sferoidów (zwykle około 48 godzin). Połowę pożywki hNs uzupełniano co drugi dzień przez usunięcie 95 µL i zastąpienie 100 µL świeżej, rozgrzanej (do 37 °C) pożywki hNs.

wytwarzanie trójwymiarowych konstrukcji wzrostu nerwów dwuwodnych

na membranach wkładek Transwell® (0,4 µm/PES; Corning) przy użyciu techniki mikro-fotolitografii podobnej do metod wcześniej opisanych15 utworzono dwuwodne rusztowanie. Wszystkie roztwory zostały wytworzone przy użyciu sterylnie filtrowanego PBS, chyba że zaznaczono inaczej. Zewnętrzny ograniczający komórki (tj. odporny na wzrost) fotoprzepuszczalny hydrożel został stworzony przy użyciu roztworu dimetakrylanu glikolu polietylenowego 1000 (PEGDMA; Polysciences, Warrington, PA) i fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosforanu litu (LAP; Sigma Aldrich). Najpierw stworzono 30% w/v PEGDMA i 1,1 mM roztwory LAP i zmieszano w roztworze 1:1. Otrzymany 15% roztwór był sterylnie filtrowany i dodawany do wkładek Transwell® umieszczonych w objętości 0,6 mL pod soczewką cyfrowego urządzenia mikro lusterek (DMD, PRO4500 Wintech Production Ready Optical Engine; Wintech Digital Systems Technology Corp, Carlsbad, CA) na szkiełkach szklanych poddanych obróbce Rain-X (ITW Global Brands, Glenview, IL) (rys. 1). Parametry maski i polimeryzacji zostały dobrane przy użyciu komercyjnego oprogramowania (DLP Lightcrafter 4500 Control Software, Texas Instruments, Dallas, TX), a naświetlanie roztworu fotorzeczywistego następowało przez 28-32 sekundy przy użyciu światła ultrafioletowego o długości fali 385 nm. Po zabiegu nadmiar roztworu PEGDMA/LAP usunięto z wkładki i z wnętrza pustki utworzonej przez maskę fotomaskową. Następnie konstrukcje przemywano 2% buforem do płukania antybiotykami/Antymikotykami (Thermo Fischer Scientific, Walton, MA) trzy razy na górze i na dole wkładki przez 10 minut każdy. Z wkładki i wewnętrznych kanałów w kształcie dziurki od klucza usunięto bufor do mycia. Pustkę starannie wypełniono 8% matrycą Matrigel® (Corning) zmniejszoną o czynnik wzrostu, tworząc przepuszczalne dla komórek rusztowanie i pozostawiono do polimeryzacji w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

Rysunek 1

projekt badania pokazujący proces wytwarzania ludzkiego nerwu na chipie (HNoaC) wraz z różnymi środkami, za pomocą których system może być scharakteryzowany. „Liczba ta nie jest objęta licencją CC BY. Podziękowania dla Anity Impagliazzo. Wszelkie prawa zastrzeżone, wykorzystane za zgodą”.

przenoszenie sferoidów do konstrukcji hydrożelowej

dwa rodzaje mediów zostały utworzone przy użyciu podłoża hNs (opisanego powyżej)w celu indukcji mielinizacji w konstrukcjach 3D zawierających hNs. Pożywkę do współkultury przedmielinizacyjnej stworzono przy użyciu pożywki hNs, 10% Hyclonu charakteryzującej płodową surowicę bydlęcą (FBS; LaCell LLC, New Orleans, LA) i 1% buforu Antybiotykowo-Antymikotycznego. Stworzono pożywkę do Współkultury Mielinizacyjnej z pożywką hNs, 10% FBS, 10 ng/mL rekombinowanego czynnika wzrostu nerwów beta szczura (NGF; R&D, Minneapolis, MN) i 50 µg/mL kwasu L-askorbinowego (Sigma-Aldrich). Po wytworzeniu sferoidy przenoszono z mikropłytki za pomocą pipety i umieszczano na 35 mm naczyniu poddanym hodowli tkankowej (Cell Treat, Pepperell, MA) w kropli pożywki hNs. Sferoidy zostały następnie umieszczone w „części żarówki” konstrukcji 3D(rys. 1) w matrycy, przy użyciu sterylizowanych kleszczy z drobnymi końcówkami Dumont # 5 (11295-10; Dumont, Montignez, Szwajcaria). 1.5 mL podłoża przedmielinizacyjnego umieszczono ostatecznie pod membraną Transwell® 6-studzienkowych płyt, a załadowane konstrukcje hydrożelowe umieszczono w inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze CO2 5% do hodowli. Połowa zmian medium była wykonywana co drugi dzień. Zarówno sferoidy monokulturowe, jak i kopkulacyjne trzymano w pożywce do hodowli przedmielinizacyjnej przez 1 tydzień, a następnie zamieniano na pożywkę do hodowli Mielinizacyjnej przez 3 tygodnie.

Immunocytochemia

przeprowadzono Immunocytochemię w celu oceny 3D wzrostu neuronów, a także migracji komórek Schwanna. Po czterech tygodniach w hodowli połowę studzienek zawierających Systemy HNoaC przemywano 3 razy PBS, utrwalano 4% paraformaldehydem (PFA; pH 7,4; Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) przez 30 minut w RT i przemywano PBS 4 razy przez 15 minut każdy. Stałe próbki umieszczano następnie w 1X roztworze blokującym zawierającym PBS, 5% normalnej surowicy koziej (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), 0,2% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) i 0,4% albuminy surowicy bydlęcej (Sigma-Aldrich) przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie znakowano następującymi pierwotnymi przeciwciałami przez noc w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C: królik-α-s100 (ab868, 1:400; Abcam, Cambridge, MA); lub mysz-α-ßIII tubulina (ab78078, 1: 500; Abcam). Białko zasadowe α-mielinowego królika (MBP, ab133620, 1: 500; Abcam) zastosowano również w oddzielnym badaniu w tych samych warunkach inkubacji.

następnego dnia studzienki przemywano PBS 4 razy przez 8 minut każdy w RT. następnie płytkę znakowano wtórnymi przeciwciałami: Alexa 488 goat anty – króliczy IgG (1:300, Abcam) lub Alexa 568 goat anty-mysi IgG (1:300, Abcam) i DAPI (1:200, Sigma-Aldrich). Przeciwciała wtórne i DAPI rozpuszczono w 1X roztworze blokera przez 90 minut w ciemności w RT. płytkę przemyto 5 razy, przez 8 minut każdy, z PBS w ciemności w RT.płytkę następnie parafilmowano, foliowano i trzymano w temperaturze 4 °C do czasu wykonania mikroskopii przy użyciu mikroskopu konfokalnego Nikon A1 (Nikon, Tokio, Japonia).

osadzanie żywicy z tworzywa sztucznego

wszystkie materiały użyte do osadzania zostały zakupione z Mikroskopii Elektronowej Sciences, o ile nie zaznaczono inaczej i były obsługiwane pod osłoną przepływu chemicznego z zalecanym sprzętem ochrony osobistej. Konstrukty hydrożelowe, które nie były używane do immunocytochemii, usunięto z hodowli i przemyto trzy razy po obu stronach studni przezbłonowej za pomocą PBS w RT przed utrwaleniem. Osadzanie tworzyw sztucznych jest niezbędne do oceny ultrastruktury aksonów, która jest trudna do określenia ilościowego przez samo wykonanie immunostaining. Następnie konstrukcje hydrożelowe moczono w roztworze 4% PFA / 0,5% aldehydu glutarowego przez 30 minut w RT. wtórne utrwalenie i zabarwienie lipidów komórkowych uzyskano przez post-utrwalenie 1% tetroksydem osmu w PBS, pH 7,4, przez 2 godziny w ciemnych warunkach W RT. Konstrukcje następnie przemywano PBS 3 razy przez 15 minut przed barwieniem 2% wodnym octanem uranylu przez 30 minut w ciemnych warunkach W RT. odwodnienie przeprowadzono stopniowymi myciami etanolowymi w RT, zaczynając od 10-minutowego mycia 50% etanolem / PBS, 10-minutowego mycia 70% etanolem/PBS i nocnego mycia 95% etanolem/PBS. Następnego dnia konstrukcje były dwukrotnie przemywane 100% etanolem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

za pomocą skalpela, konstrukcje hydrożelowe były oddzielane pojedynczo ze studni transbłonowych, bez usuwania PEGDMA, pod mikroskopem Rozbiorowym. Konstrukcje umieszczono w płaskich formach osadzających (EMS 70902, Electron Microscopy Sciences). Pozostałemu etanolowi dano czas na odparowanie ze stałych hydrożeli przed zastąpieniem pożywką infiltracyjną składającą się z mieszaniny żywicy Spurra w stosunku 1:1 (Zestaw Spurra o niskiej lepkości; mikroskopia elektronowa) i tlenku propylenu. Podłoże infiltracyjne pozostawiono na 75 minut, zanim zastąpiono je 100% żywicą Spurra, która utwardzano przez noc w piecu o temperaturze 70 °C i przez 48 godzin w temperaturze pokojowej przed sekcją ultramikrotomu.

Sekcja I transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

Sekcja i ocena TEM przeprowadzono w Shared Instrumentation Facility (SIF) na Louisiana State University (Baton Rouge, LA). Ultracienkie sekcje zostały wycięte do grubości 80-100 nm w czterech miejscach w próbce HNoaC: w obrębie żarówki tkanki, gdzie żarówka spotkała się z kanałem i kanałem proksymalnym (tj. w pobliżu żarówki) oraz kanałem dystalnym (rys. 1). Sekcje umieszczano na siatkach miedzianych pokrytych węglem, o oczkach 200 i impregnowano metalem, unosząc się na kroplach 2% octanu uranylu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. następnie płukano 3 razy kroplami wody dejonizowanej przez 1 min. Do wizualizacji użyto JEOL 1400 TEM (Peabody, MA) o napięciu przyspieszającym 120 kV przy różnych powiększeniach.

analiza Histomorfometryczna

dane uzyskane z obrazów tem przekrojów HNoaC obejmowały następujące istotne klinicznie wskaźniki, które są często związane z patologiami obwodowego układu nerwowego: mielinizowana i niemielinizowana średnica aksonu, stosunek G (tj. stosunek średnicy aksonu do średnicy całego włókna) i procent mielinizowanych włókien. Wszystkie metryki zostały wyjaśnione przez dwóch różnych, niezależnych, zaślepionych badaczy, mierząc zarówno niemielinizowane aksony, jak i aksony otoczone 3 lub więcej warstwami ciemnego owijania mielinowego. Współczynnik G i średnicę aksonu mierzono za pomocą funkcji skali, progu i pomiaru w Fiji16. Dziesięć obrazów wykonanych z całej konstrukcji zostało losowo wybranych do pomiaru. Po pierwsze, mielinizowane włókna zostały zidentyfikowane jako otoczone przez 3 lub więcej blaszek mielinowych, podczas gdy niemielinizowane włókna były nagie lub pochłonięte przez komórkę Schwanna. Średnicę aksonu włókien niemielinizowanych mierzono za pomocą funkcji progu, aby znaleźć obszar włókna. Średnica została następnie obliczona na podstawie tego pomiaru. Obliczanie współczynnika G dla mielinizowanych włókien rozpoczęło się od znalezienia wewnętrznego obszaru aksonalnego w podobny sposób jak średnica aksonu (przekroczenie całego obszaru w celu oszacowania średniej średnicy.) Po drugie, obszar zewnętrzny został zmierzony i obejmował ciemne lamele mielinowe. Przy pomiarze zewnętrznego zasięgu osłonki mielinowej wykluczono Duże ciała zarodkowe komórek Schwanna. Następnie obliczono średnice wewnętrzne i zewnętrzne na podstawie pomiaru powierzchni. Współczynnik G, jak opisano powyżej, został obliczony jako ostatni. Procent mielinizacji oceniano również na Fidżi poprzez pobranie próbek 5 mikrografów z części szyjkowej żarówki, która zawierała co najmniej 1 mielinizowane włókna i 5 nie mielinizowanych włókien. Do obliczenia procentu mielinizacji użyto prostej liczby mielinizowanych włókien oraz całkowitej liczby obserwowanych włókien.

Elektrofizjologia

po miesiącu współkultury wkładkę Transwell® z odtworzonym nerwem umieszczono na etapie badań elektrofizjologicznych. Dwie rurki, jedna do dozowania, a druga do aspiracji, zostały umieszczone wzdłuż krawędzi wkładki Transwell® do perfuzji natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)11 nad próbkami tkanek. W celu rejestracji potencjałów działania złożonego (CAP), do żarówki kanału w pobliżu skupionych ciał komórkowych wprowadzono szarpaną elektrodę mikropipetową (1-4 MΩ), a aksony rosnące w kanale stymulowano koncentryczną dwubiegunową elektrodą platynowo-irydową umieszczoną w odległości 1-3 mm od żarówki. Platynowa elektroda nagraniowa została umieszczona w szklanej mikropipetce wypełnionej ACSF i została podłączona do wzmacniacza ustawionego na wzmocnienie 100x i filtrowanie 0,1 Hz high pass do 3 kHz low pass. Wysokość i szerokość impulsu stymulacji utrzymywano odpowiednio na napięciu 10 V i 200 µsec. Próbki stymulowano z maksymalną częstotliwością powtarzania 1 Hz, a na próbkę zastosowano co najmniej 50 stymulacji. Za pomocą konwertera analogowo-cyfrowego (PowerLab; AD Instruments, Colorado Springs, CO), przebiegi CAP były wizualizowane i dalej przechowywane za pomocą oprogramowania LabChart (AD instruments). Po zarejestrowaniu nakrętki, przy użyciu stereomikroskopu i Kamery, wykonano migawkę elektrod stymulujących i rejestrujących w celu określenia odległości między nimi do obliczeń NCV. Latencję mierzono poprzez odjęcie lokalizacji artefaktu bodźca od lokalizacji szczytu CAP. NCV dla mielinizowanych współkultur hmn/hSC i niemielinizowanych monokultur hMN oceniano dzieląc odległość między elektrodami stymulującymi i rejestrującymi przez opóźnienie.

statystyki

jednokierunkowa analiza wariancji (ANOVA) za pomocą testu post-hoc Tukey została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) do oceny różnic wielkości między różnymi rodzajami sferoidów. Do analizy elektrofizjologii obliczono średnią i odchylenie standardowe oraz wykonano niesparowany test t (oprogramowanie GraphPad.) Wartość p ≤ 0,05 została wykorzystana do przypisania istotnych różnic między średnimi. Wszystkie dane zostały zebrane przy użyciu co najmniej trzech różnych replikatów.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.