Engenharia 3D humano funcional dos nervos periféricos in vitro usando o Nervo-on-a-Chip plataforma

célula de Schwann cultura

Uma T-75 cultura balão (353136; Corning, Corning, NY) foi preparado pelo revestimento com uma estéril-filtrada, de 0,1% de poli-L-ornitina (OLP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) solução, em água estéril (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). O frasco foi então lavado quatro vezes com água estéril. 7, 5 mL de 10 µg/mL de laminina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em solução salina tamponada com fosfato (PBS; Caisson Labs, Smithfield, UT) foi adicionado ao frasco, que foi mantido a 4 °C durante a noite. A solução de laminina foi aspirada e 15 mL de meio de cultura foram colocados diretamente no frasco de cultura T-75, que foi então equilibrado em uma incubadora de 37 °C antes do revestimento celular.

o meio celular humano de Schwann foi comprado de ScienCell (Carlsbad, CA). Células de Schwann primárias humanas (cat. No. 1700; ScienCell) foram recebidos em um criovial com supostamente mais de 5 × 105 células / mL. O frasco para injectáveis foi removido da criopreservação e descongelado num banho de água a 37 °C. O conteúdo do frasco para injetáveis foi distribuído uniformemente no frasco T-75 revestido com OLP/laminina. A cultura foi deixada imperturbável a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% por pelo menos 16 horas para promover o apego e a proliferação. O meio de cultura foi alterado a cada 24 horas. Ao atingir 80% de confluência, os hSCs foram passados usando 3 mL de Accutase® (Sigma-Aldrich), que foi adicionado ao frasco por 3 minutos a 37 °C. Uma vez que as células se destacaram completamente, 8 mL de meio hSC foram colocados no frasco. A solução de 11 mL de hSCs destacadas foi movida para um tubo cônico de 15 mL e girada a 200 × g (centrífuga Eppendorf 5810 R, raio de 18 cm; Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) por 5 minutos à temperatura ambiente (RT, aproximadamente 22 °C). O sobrenadante foi aspirado e o pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio de cultura hSC. As células foram contadas usando um hemocitômetro convencional (Hausser Scientific, Horsham, PA).

cultura do neurônio Motor

neurônio Motor iCell® (hNs; O meio FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc) foi preparado usando 100 mL de meio Base de neurônios iCell® (FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc, Madison, WI) suplementado com 2 mL de suplemento Neural iCell® A e 1 mL de suplemento ao sistema nervoso iCell®. Para se preparar para o descongelamento do hNs, o meio hNs foi aquecido a RT e 1 mL de meio hNs foi adicionado a um tubo cônico estéril de 50 mL. Um frasco para injectáveis de hNs foi descongelado num banho de água a 37 °C durante aproximadamente 2 minutos e 30 segundos. O conteúdo do frasco para injetáveis foi transferido para o tubo cônico de 50 mL contendo 1 mL de meio hNs, gota a gota com um movimento de roda, para misturar completamente a solução celular e minimizar o choque osmótico nas células descongeladas. O frasco para injectáveis de células foi então enxaguado com 1 mL de meio hNs e transferido para o tubo de 50 mL. O volume da solução foi então levado a 10 mL adicionando lentamente o meio hNs ao tubo de centrífuga de 50 mL gota a gota (2-3 gotas/seg) enquanto girava. A solução celular foi então transferida para um tubo cônico de 15 mL e centrifugada a 200 × g por 5 minutos em RT. O sobrenadante foi aspirado e as células foram ressuspendidas em 1 mL de meio hNs sacudindo o tubo e depois pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes. Uma amostra de 10 µL de solução celular foi então retirada para realizar uma contagem de células usando um hemocitômetro.

fabricação esferóide

um fundo redondo “U” não tratado, claro, 96 bem, microplaca esferóide (4515; Corning) foi usado para monoculturas de hNs e hSCs, bem como co-culturas de hNs/hSCs. A concentração de células/µL de mídia foi calculado para ambas as hSCs e hNs para permitir o cálculo dos volumes necessários para produzir esferóides dos seguintes tamanhos e composições: hNs mono-culturas – 100000, 75000, 50000, ou 25000; hSCs mono-culturas – 75000, 50000, ou 25000; e co-culturas, 75000 hNs com 75000, 25000 50000 ou hSCs. As composições foram escolhidas para garantir que possamos encaixar o maior esferóide possível na dimensão do sistema de hidrogel duplo para obter densidade axonal máxima no canal, tornando as gravações eletrofisiológicas mais confiáveis. O volume calculado foi adicionado aos micropoços de placas, então o volume de cada poço foi trazido para 200 µL por adição de mídia aquecido a 37 °C. A esfera de microplacas foi, em seguida, centrifugadas a 200 x g por 5 minutos e colocados em 37 °C incubadora em um 5% de CO2 a atmosfera até esfera de formação foi observada (normalmente em cerca de 48 h). Metade do meio hNs foi reabastecido a cada dois dias, removendo 95 µL e substituindo por 100 µL de meio hNs fresco e aquecido (a 37 °C).

fabricação de construções de crescimento do nervo de hidrogel duplo 3D

um andaime de hidrogel duplo foi criado nas membranas das inserções Transwell® (0,4 µm/PES; Corning) usando uma técnica de micro-fotolitografia semelhante aos métodos anteriormente descritos15. Todas as soluções foram criadas com PBS filtrados estéreis, salvo indicação em contrário. O hidrogel foto-translinável restritivo da célula externa (ou seja, resistente ao crescimento) foi criado usando uma solução de polietileno glicol dimetacrilato 1000 (PEGDMA; Polysciences, Warrington, PA) e lítio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP; Sigma Aldrich). Primeiro, 30% W/V PEGDMA e soluções de volta de 1,1 mM foram criadas e misturadas em uma solução 1:1. Resultante de 15% solução foi esterilizada-filtrado e adicionado ao Transwell® pastilhas colocado em um volume de 0,6 mL enquanto posicionado sob a lente de um Digital Micromirror Device (DMD, PRO4500 Wintech Pronto para Produção do Motor Óptico; Wintech Sistemas Digitais Tecnologia Corp, Carlsbad, CA) em Rain-X (ITW Marcas Globais, Glenview, IL)-tratados lâminas de vidro (Fig. 1). Os parâmetros de máscara e polimerização foram selecionados por meio de software comercial (DLP Lightcrafter 4500 Control Software, Texas Instruments, Dallas, TX), e a irradiação da solução fototransformável ocorreu por 28-32 segundos usando a luz ultravioleta de 385 nm de comprimento de onda. Após o tratamento, o excesso de solução PEGDMA/LAP foi removido da inserção e de dentro do vazio criado pela fotomáscara. Os construtos foram então lavados com tampão de lavagem antibiótico/Antimicótico a 2% (Thermo Fischer Scientific, Walton, MA) três vezes na parte superior e inferior da inserção por 10 minutos cada. O tampão de lavagem foi removido da inserção e dos canais internos em forma de Buraco da fechadura. O vazio foi cuidadosamente preenchido com matriz Matrigel ® reduzida por Fator de crescimento de 8% (Corning) para criar um andaime permeável à célula e permitido polimerizar em uma incubadora de 37 °C.

Figura 1

projeto de Estudo mostrando o processo de fabricação de um ser Humano Nervo-on-a-Chip (HNoaC), juntamente com vários meios pelos quais o sistema pode ser caracterizado. “Este número não é coberto pelo CC por licença. Créditos para Anita Impagliazzo. Todos os direitos reservados, usados com permissão”.

transferência de esferóides para hidrogel construir

dois tipos de meios foram criados usando meio hNs (descrito acima) para induzir mielinização em construções 3D contendo hNs. Um meio de co-cultura de pré-mielinização foi criado usando meio hNs, soro fetal bovino caracterizado por 10% de Hiclone (FBS; LaCell LLC, Nova Orleans, LA) e tampão antibiótico-Antimicótico de 1%. Um meio de co-cultura de mielinização foi criado com meio hNs, 10% FBS, 10 ng / mL de fator de crescimento beta-nervoso recombinante de rato (NGF; R & sistemas D, Minneapolis, MN) e 50 µg / mL de ácido L-ascórbico (Sigma-Aldrich). Após a formação, os esferóides foram transferidos da microplaca usando uma pipeta e colocados em um prato tratado com cultura de tecido de 35 mm (Tratamento celular, Pepperell, MA) em uma gota de meio hNs. Os esferóides foram então colocados na construção 3D “porção de bulbo” (Fig. 1) dentro do Matrigel, usando fórceps esterilizados Dumont # 5 de ponta fina (11295-10; Dumont, Montignez, Suíça). 1.5 mL de meio de pré-mielinização foram finalmente colocados sob a membrana Transwell® das placas de 6 poços, e os construtos de hidrogel carregados foram colocados em uma incubadora de 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5% para cultura. Metade das mudanças do meio foram realizadas a cada dois dias. Os esferóides mono e co-cultura foram mantidos no meio de co-cultura de pré-mielinização por 1 semana antes de serem transferidos para o meio de co-cultura de mielinização por 3 semanas.

Imunocitoquímica

Imunocitoquímica foi realizada para avaliar o 3D conseqüência dos neurônios, bem como a migração das células de Schwann. Após quatro semanas em cultura, metade dos poços contendo sistemas HNoaC foram lavados 3 vezes com PBS, fixados com paraformaldeído a 4% (PFA; pH 7,4; Ciências de Microscopia Eletrônica, Hatfield, PA) por 30 min em RT, e lavados com PBS 4 vezes por 15 minutos cada. As amostras fixas foram então colocadas em uma solução bloqueadora 1x contendo PBS; soro normal de cabra a 5% (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA); Triton-X-100 a 0,2% (Sigma-Aldrich); e albumina sérica bovina a 0,4% (Sigma-Aldrich) por uma hora em RT, seguida de rotulagem com os seguintes anticorpos primários durante a noite na solução bloqueadora a: coelho-α-S100 (ab868, 1: 400; Abcam, Cambridge, MA); ou rato-α-ßIII Tubulin (ab78078, 1: 500; Abcam). A proteína básica de coelho-α-mielina (MBP, ab133620, 1:500; Abcam) também foi usada em um ensaio separado sob as mesmas condições de incubação.

no dia seguinte, os poços foram lavados com PBS 4 vezes por 8 min Cada na RT. a placa foi então rotulada com anticorpos secundários, Alexa 488 goat Anti-rabbit IgG (1:300, Abcam) ou Alexa 568 goat Anti-mouse IgG (1:300, Abcam) e DAPI (1:200, Sigma-Aldrich). Anticorpos secundários e DAPI foram dissolvidos em 1X bloqueador de solução para 90 minutos no escuro RT. A placa foi lavada 5 vezes, por 8 minutos cada, com PBS no escuro a RT. A placa foi então parafilmed, frustrado, e mantido a 4 °C até a microscopia foi realizada utilizando uma Nikon A1 microscópio confocal (Nikon, Tóquio, Japão).

incorporação de resina plástica

todos os materiais usados para incorporação foram adquiridos da Electron Microscopy Sciences, salvo indicação em contrário, e foram manuseados sob um exaustor de fluxo químico com equipamento de proteção individual recomendado. Construções de hidrogel que não foram usadas para imunocitoquímica foram removidas da cultura e lavadas três vezes em ambos os lados do poço transmembrana com PBS em RT antes da fixação. A incorporação de plástico é essencial para avaliar a ultraestrutura dos axônios, que é difícil de quantificar apenas realizando imunocoloração. Os construtos de hidrogel foram então embebidos em uma solução de 4% de PFA/0,5% de glutaraldeído por 30 minutos em RT. fixação secundária e coloração de lipídios celulares foi obtida por pós-fixação com 1% de tetróxido de ósmio em PBS, pH 7,4, por 2 horas em condições escuras em RT. As construções, em seguida, foram lavadas com PBS por 3 vezes, por 15 minutos antes de counterstaining com aquosa a 2% de acetato de uranilo por 30 minutos, sob condições escuras no RT. A desidratação foi feita com classificados de etanol lava no RT, começando com uma caminhada de 10 minutos lave com 50% de etanol/PBS, a 10 minutos a lavagem com etanol a 70%/PBS e uma noite de lavagem com etanol a 95%/PBS. No dia seguinte, os construtos foram lavados duas vezes com etanol a 100% por 30 minutos em RT.

com bisturi, os constructos de hidrogel foram dissecados individualmente dos poços transmembranares, sem remoção do PEGDMA, sob um microscópio dissecante. Os constructos foram colocados em moldes de incorporação plana (EMS 70902, Electron Microscopy Sciences). O etanol restante recebeu tempo para evaporar dos hidrogéis fixos antes da substituição por meio de infiltração consistindo em uma mistura 1:1 de resina de Spurr (Kit de Spurr de mídia de incorporação de baixa viscosidade; Ciências de Microscopia Eletrônica) e óxido de propileno. O meio de infiltração foi deixado por 75 minutos antes de ser substituído por 100% de resina de Spurr, que foi curada durante a noite em um forno de 70 °C e por mais 48 horas em RT antes do corte ultramicrotome.

microscopia eletrônica de seção e transmissão (TEM)

a avaliação de seção e TEM foi realizada na instalação de instrumentação compartilhada (Sif) na Louisiana State University (Baton Rouge, LA). Seções ultrafinas foram cortadas a uma espessura de 80-100 nm em quatro locais dentro do espécime HNoaC: dentro do bulbo do tecido, onde o bulbo encontrou o canal e o canal proximal (ou seja, perto do bulbo), e canal distal (Fig. 1). As seções foram colocadas em grades de cobre revestidas de carbono Formvar, malha 200, e impregnadas com metal flutuando em gotículas de acetato de uranila a 2% por 20 minutos em RT. eles foram então enxaguados com gotículas de água desionizadas 3 vezes, por 1 min. Para visualizar, um JEOL 1400 TEM (Peabody, MA) foi usado com uma tensão de aceleração de 120 kV em ampliações variáveis.

Histomorphometric análise

Dados adquiridos a partir de DEZ imagens de HNoaC seções transversais incluídos os seguintes clinicamente relevantes métricas que são comumente associados com patologias do sistema nervoso periférico: mielinizadas e unmyelinated axon diâmetro, G-relação (por exemplo, a relação entre o axônio de diâmetro o diâmetro de toda a fibra ), e porcentagem de fibras mielinizadas. Todas as métricas foram elucidadas por dois pesquisadores diferentes, independentes e cegos, medindo axônios e axônios não mielinados cercados por 3 ou mais camadas de envolvimento de mielina escura. A razão G e o diâmetro do axônio foram medidos usando as funções de escala, limiar e medida em Fiji16. Dez imagens tiradas de todo o construto foram selecionadas aleatoriamente para medição. Primeiro, as fibras mielinizadas foram identificadas como sendo cercadas por 3 ou mais lâminas de mielina, enquanto as fibras não mielinadas estavam nuas ou engolfadas por uma célula de Schwann. O diâmetro do axônio das fibras não mielinadas foi medido usando a função limiar para encontrar a área da fibra. O diâmetro foi então calculado a partir desta medição. O cálculo da razão G para fibras mielinizadas começou encontrando a área axonal interna de forma semelhante ao diâmetro do axônio (debulhando toda a área para estimar o diâmetro médio.) Em segundo lugar, a área externa foi medida e incluiu as lamelas de mielina escura. Os grandes corpos nucleados das células de Schwann foram excluídos ao medir a extensão externa da bainha de mielina. Os diâmetros interno e externo foram então calculados a partir da medição da área. A razão G, conforme descrito acima, foi calculada por último. A mielinização percentual também foi avaliada em Fiji por amostragem de 5 micrografias da porção cervical do bulbo que continham pelo menos 1 fibra mielinizada e 5 fibras não mielinizadas. Um registro simples de fibras mielinizadas observado e fibras totais observadas foi usado para calcular a mielinização percentual.

Eletrofisiologia

após um mês em co-cultura, a inserção Transwell® com o nervo reconstituído foi colocada em um palco para testes eletrofisiológicos. Dois tubos, um para dispensação e outro para aspiração, foram colocados ao longo das bordas do Inserto Transwell® para perfusão de líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado (ACSF)11 sobre amostras de tecido. Para registrar potenciais de ação composta (CAP), um eletrodo de micropipeta de vidro puxado (1-4 MΩ) foi inserido no bulbo do canal próximo aos corpos celulares agrupados, e os axônios que crescem no canal foram estimulados com um eletrodo de platina-irídio bipolar concêntrico posicionado 1-3 mm distal ao bulbo. Um eletrodo de gravação de platina foi colocado na micropipeta de vidro cheia de ACSF e foi conectado a um amplificador com ganho de 100x e passagem alta de 0,1 Hz para filtragem de passagem baixa de 3 kHz. A altura e a largura do pulso de estimulação foram mantidas em 10 volts e 200 µsec, respectivamente. As amostras foram estimuladas a uma taxa máxima de repetição de 1 Hz e pelo menos 50 estímulos foram aplicados por amostra. Usando um conversor analógico-digital (PowerLab; AD Instruments, Colorado Springs, CO), as formas de onda CAP foram visualizadas e armazenadas usando o software LabChart (AD instruments). Após a gravação da tampa, usando um estereomicroscópio e câmera, um instantâneo dos eletrodos estimulantes e de gravação foi feito para determinar a distância entre eles para o cálculo do NCV. A latência foi medida subtraindo a localização do artefato de estímulo pela localização do Pico da tampa. O NCV para co-culturas de hMN/hSC mielinizadas e monoculturas de hMN não mielinizadas foi avaliado dividindo a distância entre eletrodos estimulantes e de registro por latência.

Estatísticas

análise de variância unidirecional (ANOVA) com Teste post-hoc Tukey foi realizada usando o software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA) para avaliar diferenças de tamanho entre diferentes tipos de esferóides. Para análise da eletrofisiologia, foram calculadas a média e o desvio padrão e realizado um teste t não pareado (software GraphPad.) Um valor p ≤ 0,05 foi usado para atribuir diferenças significativas entre as médias. Todos os dados foram coletados usando pelo menos três repetições diferentes.

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