Serviços de microinjeção

o serviço de microinjeção (MIJ) é composto pelas instalações, instrumentação e conhecimentos técnicos necessários para realizar a microinjeção, uma etapa essencial no processo para criar um modelo de mouse geneticamente modificado. A equipe do MIJ realiza a atividade diária de manejo de colônias de camundongos, superovulação, colheita de embriões, injeção pronuclear, citoplasmática e blastocisto e cirurgia de transferência de embriões. As ofertas de serviço incluem microinjeção de reagentes CRISPR ou uma construção de DNA, incluindo Bac (cromossomo artificial bacteriano), no zigoto de muitas cepas inbred e especializadas de camundongos. Também oferecemos injeção de células ES em embriões de blastocisto e estágio de 8 células de cepas convencionais de camundongos e esquema de cores de pelagem é usado sempre que possível para facilitar a avaliação do quimerismo. Os serviços do MIJ também tiveram muito sucesso na criação de modelos animais nocaute usando ZFN (Zinc Finger Nuclease) e TALEN (ativador de transcrição como Effector Nuclease) tecnologias diretamente em cepas inbred e especializadas. O serviço de microinjeção atualmente possui 5 estações completas de microinjeção e 3 estações cirúrgicas completas. O equipamento chave inclui: 3 máquinas da Anestesia de Vetequipp, 3 sistemas do laser de XYClone, 14 stereomicroscopes, 6 incubadoras do benchtop, 2 Sutter e 2 puxadores do micropipette de Kopf, 2 brocas Piezo e 3 microforges.

Produção Do Modelo Do Rato:

  • os modelos Knockout e knockin mouse são produzidos pela injeção de reagentes CRISPR nos zigotos (0,5 dpc) da cepa Hospedeira desejada. Esses embriões se desenvolvem a termo após a transferência cirúrgica para um receptor cbyb6f1/J pseudopregnant rato fêmea. O RNA guia reconhece o locus genômico por emparelhamento de base, e a nuclease Cas9 gera uma quebra de fita dupla (DSB) no genoma. Se nenhum DNA de doador for usado, o DSB é reparado pelo mecanismo propenso a erros de junção de extremidade não homóloga (NHEJ) que geralmente carrega uma mutação frameshift. No entanto, quando o DNA do doador é fornecido e usado, o reparo direcionado à homologia (HDR) mediará a incorporação de uma mutação pontual, a inserção de uma tag ou um local loxP ou a troca do gene Murino com seu ortólogo humano.
  • camundongos transgênicos são produzidos por microinjeção de um gene purificado construir no pronúcleo de zigotos (0,5 dpc) da cepa Hospedeira desejada. Esses embriões se desenvolvem a termo após a transferência cirúrgica para um receptor cbyb6f1/J pseudopregnant rato fêmea. Os filhotes resultantes são transferidos para o investigador para identificação de transgene-portadores. Esses ratos “fundadores” são então criados pelo investigador para análise de expressão.
  • camundongos mutantes direcionados são produzidos pela microinjeção de células-tronco embrionárias geneticamente modificadas (ES) em embriões de camundongos em estágio de blastocisto (3,5 dpc). Após a transferência cirúrgica e o desenvolvimento a termo, as quimeras (derivadas do embrião hospedeiro e das células introduzidas) são identificadas pela cor da pelagem e criadas pelo investigador para a transmissão da linha germinativa da linhagem celular es manipulada.

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