Timp pentru a instiga PCR imbricate

cum să obțineți un produs PCR mai pur și să reduceți amplificarea nespecifică

dacă nu ați pus mâna pe niște primeri specifici miraculos, amplificarea doar a secvenței țintă fără amplificare nespecifică poate fi foarte dificilă. Din fericire, o soluție inteligentă și surprinzător de simplă este la îndemână!

o recapitulare rapidă a elementelor de bază

în PCR, proiectați primerii pentru a se lega de secvența pe care doriți să o amplificați. Se utilizează o pereche de primeri, numiți primeri înainte și invers, pentru a vă asigura că ambele fire ale secvenței dvs. sunt amplificate. Speranța este că după 30-40 de cicluri, veți avea un produs aproape pur cu care să lucrați. Din păcate, această speranță este mai mult ca un vis atunci când primerii tăi sunt mai puțin pretențioși decât ți-ai dori când vine vorba de secvențele pe care le vor lega. Rezultatul final este un produs impur care poate fi inutilizabil, în funcție de cât de multă legare nespecifică a avut loc și de ceea ce aveți nevoie de produsul PCR.

o soluție simplă: PCR imbricat

PCR imbricat este o soluție cu adevărat elegantă. Folosește două perechi de primeri: primul set leagă secvența țintă, dar mai degrabă decât să se lege strâns de începutul secvenței, le proiectați pentru a se lega puțin mai departe (prin set înțelegem un primer înainte și invers). Rulați PCR-ul și ajungeți la un produs care conține atât secvența țintă, cât și secvențele nespecifice. Apoi utilizați un al doilea set de grunduri, care au fost proiectate așa cum ați proiecta în mod normal grunduri, unde se leagă la sau aproape de începutul secvenței țintă.

a avea două perechi de primeri acționează ca o verificare dublă. Pot exista mai multe secvențe în materialul dvs. de pornire care conține un șir de baze la care se va lega un set de grunduri, dar este statistic foarte puțin probabil ca acestea să conțină șiruri de bază capabile să lege ambele seturi de grunduri. Prin urmare, puteți fi siguri că produsul dvs. este ceea ce aveți nevoie pentru a fi din cauza acestui nivel suplimentar de selectivitate. Puteți afla mai multe despre grundurile imbricate și rolul lor în TAIL-PCR aici și puteți vedea o reprezentare vizuală a procesului aici.

sfaturi suplimentare pentru a vă crește specificitatea

specificitatea PCR este determinată de specificitatea primerilor PCR. Aceasta este una dintre regulile cardinale ale PCR. Pentru a crește specificitatea primerilor dvs., încercați următoarele:

  1. BLAST Search
    efectuați o căutare BLAST pentru a vedea dacă gena/secvența de interes a fost secvențiată înainte. Dacă da, acest lucru vă poate permite să proiectați primeri foarte specifici.
  2. PCR Electronic
    o altă soluție tehnologică este PCR Electronic, care vă permite să rulați o simulare computerizată a procesului PCR pentru a verifica rezultatul teoretic al PCR.
  3. grundurile mai lungi sunt mai puțin susceptibile de a lega alte secvențe, deoarece există mai puține șanse ca acestea să se lege suficient de eficient pentru a permite amplificarea, deși există un echilibru și grundurile pot fi prea lungi (vezi AICI.)
  4. prea multe baze G și C într-un grund îl fac prea lipicios. Din păcate, prea puțini G și C și primerii dvs. sunt puțin probabil să recoacă ceva. Există un echilibru, dar de obicei un conținut de GC de 40-60% este ideal.
  5. găsiți temperatura optimă de recoacere. Aceasta este temperatura la care cel puțin 50% din grunduri își vor lega secvența complementară. Dacă temperatura este prea scăzută, grundurile devin mai susceptibile de a lega secvențe nespecifice. Dacă nu cunoașteți temperatura optimă, puteți utiliza fie touchdown PCR (presupunând că nu trebuie să știți care s-a dovedit a fi temperatura), fie să utilizați o temperatură de recoacere diferită pentru fiecare godeu și să vedeți ce produs este cel mai pur prin electroforeză în gel (presupunând că doriți să știți care este temperatura optimă de recoacere).
  6. un dezechilibru în concentrația dNTP-urilor poate provoca, de asemenea, probleme, la fel ca și o concentrație prea mare de dNTP-uri. Verificați-vă rețeta cu un coleg pentru orice eventualitate.
  7. unii aditivi pot fi utilizați pentru a destabiliza duplexurile ADN dacă bănuiți că dimerii de grund sau structurile secundare, cum ar fi părul de păr, cauzează o problemă. În primul rând, încercați să reduceți concentrația de ioni de clorură de magneziu, deoarece acest lucru poate reduce legarea nespecifică, deoarece concentrațiile mai mari ale ionului stabilizează duplexurile. În caz contrar, adăugarea DMSO poate ajuta. Puteți găsi o listă cu diverși aditivi pentru PCR aici.
  8. în caz contrar toate acestea, încercați o polimerază de pornire la cald. Aceste polimeraze funcționează numai la temperaturi mai ridicate, prevenind amplificarea la temperaturi mai scăzute atunci când primerii se leagă mai ușor de secvențele nețintă.

vă rugăm să adăugați propriile sfaturi în comentariile de mai jos.

PCR intercalat termic asimetric (TAIL-PCR) (pentru a afla mai multe despre una dintre formele de PCR care se bazează pe primeri imbricate)

primeri imbricate pentru PCR (pentru un vizual cu privire la modul de lucru primeri imbricate)

(pentru a afla despre cum să crească eficiența primeri dumneavoastră dacă utilizați TAIL-PCR)

te-a ajutat asta? Apoi, vă rugăm să partajați cu rețeaua.

scris de Olwen Reina

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.