Dags att inleda kapslad PCR

hur man får en renare PCR-produkt och minskar icke-specifik förstärkning

om du inte har fått händerna på några mirakulöst specifika primers kan förstärkning av endast din målsekvens utan icke-specifik förstärkning vara mycket utmanande. Tack och lov finns en smart och överraskande enkel lösning till hands!

en snabb sammanfattning av grunderna

i PCR designar du dina primers för att binda till den sekvens du vill förstärka. Ett par primers används, kallas framåt och bakåt primers, för att säkerställa båda delarna av din sekvens förstärks. Förhoppningen är att efter 30-40 cykler har du en nästan ren produkt att arbeta med. Tyvärr är detta hopp mer som en dröm när dina primers är mindre kräsna än du vill när det gäller vilka sekvenser de binder. Slutresultatet är en oren produkt som kan vara oanvändbar, beroende på hur mycket icke-specifik bindning som inträffade och för vad du behöver PCR-produkten.

en enkel lösning: kapslad PCR

kapslad PCR är en verkligt elegant lösning. Den använder två par primers: den första uppsättningen binder din målsekvens men snarare än att binda nära början av sekvensen, utformar du dem för att binda lite längre bort (med set menar vi en framåt och omvänd primer). Du kör din PCR och slutar med en produkt som innehåller både målsekvensen och icke-specifika sekvenser. Du använder sedan en andra uppsättning primers, som har utformats som du normalt skulle utforma primers, där de binder vid eller nära början av målsekvensen.

att ha två par primers fungerar som en dubbelkontroll. Det kan finnas flera sekvenser inom ditt utgångsmaterial som innehåller en sträng av baser till vilka en uppsättning primers kommer att binda men det är statistiskt mycket osannolikt att de kommer att innehålla bassträngar som kan binda båda uppsättningen primers. Därför kan du vara säker på att din produkt är vad du behöver för att vara på grund av denna extra selektivitet. Du kan lära dig mer om kapslade primers och deras roll i TAIL-PCR här och se en visuell representation av processen här.

ytterligare Tips för att öka din specificitet

specificiteten för PCR bestäms av specificiteten hos PCR-primrarna. Detta är en av kardinalreglerna för PCR. För att öka specificiteten hos dina primers, prova följande:

  1. BLAST Search
    utför en BLASTSÖKNING för att se om din gen/sekvens av intresse har sekvenserats tidigare. Om så är fallet kan detta göra att du kan designa mycket specifika primers.
  2. elektronisk PCR
    en annan teknisk lösning är elektronisk PCR som låter dig köra en datorsimulering av PCR-processen för att kontrollera det teoretiska resultatet av din PCR.
  3. längre primers är mindre benägna att binda andra sekvenser eftersom det finns mindre chans att de binder tillräckligt effektivt för att möjliggöra förstärkning, även om det finns en balans och primers kan vara för långa (se här.)
  4. för många g-och C-baser i en primer Gör det för klibbigt. Tyvärr är det för få G och C och dina primers osannolikt att glödga någonting. Det finns en balans, men vanligtvis är ett GC-innehåll på 40-60% idealiskt.
  5. Hitta den optimala glödgningstemperaturen. Detta är den temperatur vid vilken minst 50% av primrarna binder sin komplementära sekvens. Om temperaturen är för låg blir primrarna mer benägna att binda icke-specifika sekvenser. Om du inte vet den optimala temperaturen kan du antingen använda touchdown PCR (förutsatt att du inte behöver veta vad temperaturen visade sig vara) eller använda en annan glödgningstemperatur för varje brunn och se vilken produkt som är den renaste genom gelelektrofores (förutsatt att du vill veta vad den optimala glödgningstemperaturen är).
  6. en obalans i koncentrationen av dNTPs kan också orsaka problem, liksom för hög koncentration av dNTPs. Dubbelkolla ditt recept med en kollega för säkerhets skull.
  7. vissa tillsatser kan användas för att destabilisera DNA-duplex om du misstänker att primerdimerer eller sekundära strukturer som hårnålar orsakar problem. Försök först minska din koncentration av magnesiumkloridjoner eftersom detta kan minska icke-specifik bindning eftersom högre koncentrationer av jonen stabiliserar Duplex. Om du inte lägger till DMSO kan det hjälpa. Du kan hitta en lista över olika tillsatser för PCR här.
  8. om du inte lyckas med allt detta, prova ett hot-start-polymeras. Dessa polymeraser fungerar endast vid högre temperatur och förhindrar förstärkning vid lägre temperatur när primrarna binder lättare till icke-målsekvenser.

vänligen lägg till dina egna tips i kommentarerna nedan.

termisk Asymmetrisk Interlaced PCR (TAIL-PCR) (för att lära sig om en av de former av PCR som bygger på kapslade primers)

kapslade Primers för PCR (för en visuell om hur kapslade primers fungerar)

(för att lära sig om hur du ökar effektiviteten hos dina primers om du använder TAIL-PCR)

har detta hjälpt dig? Vänligen dela med ditt nätverk.

skriven av Olwen Reina

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.